《Journal of Separation Science》：Enabling Large-Volume Injections in Hydrophilic Interaction Chromatography of Oligonucleotides Through In-Line Mixing
编辑推荐：
本文综述探讨了在治疗性寡核苷酸（ONs）的亲水作用色谱（HILIC）分析中，如何通过引入在线混合器来解决因大体积、高水相样品进样而导致的溶剂不匹配（突破、峰裂分）问题，从而实现灵敏、可靠的杂质分析。
在治疗性寡核苷酸（ONs）的分析领域，亲水作用色谱（HILIC）因其独特的选择性和与质谱（MS）的良好兼容性而备受关注。然而，由于寡核苷酸极性高，通常溶解于高水相溶剂中，而典型的HILIC流动相则含有高比例有机溶剂（如乙腈，ACN），这种样品溶剂与流动相之间的巨大差异，往往导致样品“突破”和色谱峰裂分，特别是当需要大体积进样以提高低浓度杂质检测灵敏度时。为了应对这一挑战，研究者们评估了一种在线混合（in-line mixing）策略，通过在进样器和色谱柱之间安装一个静态混合器，旨在促进样品溶剂与流动相的均质化，从而缓解溶剂不匹配问题。
1 引言：HILIC在寡核苷酸分析中的挑战与机遇
治疗性寡核苷酸（包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNA）等）是一类重要的药物，其分析对质量控制和杂质鉴定至关重要。相较于反相离子对色谱（IP-RPLC）和阴离子交换色谱（AEX），HILIC具有独特的分离选择性和与质谱的兼容性优势。然而，HILIC对样品溶剂和进样体积极为敏感，注入大体积水相样品常导致峰形变差。传统解决方案包括在弱溶剂中溶解样品、小体积进样或使用性能优化进样序列（POISe）等技术，而在线混合作为一种不需要辅助泵的简化设置方案，在解决溶剂不匹配问题方面展现潜力，本研究即旨在系统评估其在HILIC分析寡核苷酸中的效用。
2 材料与方法：评估系统搭建
研究使用Agilent 1290 Infinity II UHPLC系统，配备Waters ACQUITY Premier BEH Amide（2.1 × 150 mm）色谱柱。核心在于通过阀切换，在进样器和色谱柱之间连接不同体积的惰性静态混合器（35 μL的混合器A和100 μL的混合器B），并与无混合器的配置进行对比。测试样品包括中等极性的核酸碱基（腺嘌呤A、尿嘧啶U、胞嘧啶C）混合物，以及一个15/16/17聚体寡核苷酸（ON）混合物（包含全长产物FLP及其N-1和N+1变体）和治疗性反义寡核苷酸（ASO X）。实验分别在等度和梯度HILIC条件下进行，系统地改变样品溶剂组成（水-乙腈比例）和进样体积（1 μL至40 μL），以评估在线混合对色谱行为的影响。
3 结果与讨论：在线混合的作用与局限性
3.1 等度HILIC分析核酸碱基：混合器不总是有效
首先，研究者以核酸碱基为模型，在等度条件下（流动相为100 mM甲酸铵水溶液-ACN， 10:90， v/v）考察了进样条件的影响。当样品溶解在较弱溶剂（水-ACN， 20:80， v/v）时，随着进样体积增加至5 μL及以上，峰开始展宽甚至裂分，这主要是体积过载效应。当使用强溶剂（水-ACN， 90:10， v/v）时，即使是1 μL的小体积进样也会导致峰展宽，更大体积则造成严重的峰变形。在此情况下，引入35 μL或100 μL的在线混合器并未改善峰形，反而加剧了谱带展宽。其根本原因在于，在线混合虽然能均质化样品，但未能将进样塞的溶剂强度降低到足以在柱头实现溶质“在线聚焦”的条件，而混合器自身的体积增加了额外的展宽。因此，对于等度HILIC，在线混合对改善强溶剂中的大体积进样效果有限。
3.2 梯度HILIC分析寡核苷酸：在线混合展现优势
研究者随后将目光转向更具实际意义的梯度HILIC分析寡核苷酸。实验采用从高有机相（起始条件为60% B， B为25 mM醋酸铵的ACN-水 80:20， v/v溶液）向高水相梯度变化的洗脱程序。当ON混合物溶解在弱溶剂（水-ACN， 30:70， v/v）时，由于样品溶剂强度低于起始流动相，形成了理想的柱上聚焦条件，因此进样体积高达20 μL（相当于柱体积的5.7%）时仍能获得良好的分离和尖锐对称的峰。当进样体积增至40 μL时，无混合器配置下峰开始变形，而加入混合器A或B则可恢复峰形，表明混合促进了溶剂混合，缓解了过载效应。
更具挑战性的情况是样品完全溶解在水中（100%水）。此时，即使进样体积仅为2 μL，也能获得良好峰形，但超过2 μL（如5 μL）就会导致ON部分“涂抹”在7-12分钟的宽洗脱区间，而10 μL及以上的进样则引发主要成分在死体积（t0）处的严重“突破”，表明样品塞未能与流动相充分混合，ON无法在柱头有效保留。在线混合器的引入显著改善了这种情况。使用35 μL的混合器A，可部分缓解20 μL水相进样时的突破，但无法完全阻止峰裂分，对40 μL进样则失效。然而，当使用100 μL的混合器B时，即使是40 μL水相样品的进样，也能完全避免突破和峰裂分，尽管分辨率因进样体积和混合器死体积增加而略有下降（峰宽从0.15分钟增至0.22分钟），但三个ON仍能实现基线分离。关键在于，梯度起始的有机相比例（60% B， 即64% ACN）必须显著高于目标分析物的洗脱有机相比例（首个洗脱的N-1约为55.7% ACN），这样才能为在线混合后的“柱上聚焦”创造条件。实验证明，如果梯度起始条件与洗脱条件过于接近，即使使用在线混合器也无法获得好的分离效果。
3.3 在线混合在实际治疗性反义寡核苷酸（ASO）杂质分析中的应用
为了验证该策略的实际应用价值，研究者将其用于一个治疗性反义寡核苷酸（ASO X）的HILIC分析。在杂质分析中，常需通过大体积进样稀释后的样品来维持对痕量杂质（<1%）的检测限。当直接进样20 μL溶解于水的ASO X样品时，主峰发生严重突破。而在安装100 μL混合器B后，突破和峰裂分现象被完全消除，得到了尖锐、对称的主峰。通过对基线区域的放大观察，可以清晰分辨出主峰前后的数个微量杂质峰，其中丰度最低的杂质估计浓度低至约100 ng mL-1。这突显了在不牺牲色谱性能的前提下，实现寡核苷酸水相样品大体积进样的重要性。
4 结论
本研究系统评估了在线混合技术在HILIC分析寡核苷酸中的应用。对于等度HILIC分析中等极性化合物，在线混合因无法实现柱上聚焦且增加死体积，改善效果有限。然而，在梯度HILIC分析高极性寡核苷酸时，在线混合被证明是缓解样品溶剂与流动相不匹配问题的有效策略。混合器体积越大，可耐受的水相样品进样体积也越大。一个100 μL的在线混合器允许进样高达40 μL的水相寡核苷酸样品，而不会引起分析物突破或峰裂分。该方法成功应用于治疗性反义寡核苷酸的杂质分析，实现了对低于1%水平杂质的检测。因此，在线混合为HILIC中的溶剂不匹配问题提供了一种简单易行的实用解决方案，可作为POISe和柱上稀释（ACD）等技术的有效替代方案。
