《Virulence》：Platelet–Neutrophil interactions in Klebsiella pneumoniae invasive syndrome: The role of aspirin
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本文深入探讨了肺炎克雷伯菌侵袭综合征（KPIS）的致病新机制，聚焦于高血糖（Hyperglycemia）环境下血小板（Platelet）与中性粒细胞（Neutrophil）之间的相互作用。研究揭示，高血糖会显著增强高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）诱导的血小板活化（CD61+/CD62P+）及血小板-中性粒细胞聚集体（PNA）形成，从而加剧感染与血栓并发症。阿司匹林（Aspirin）的有效成分水杨酸（SA）被证明能通过抑制血小板活化和增强中性粒细胞杀菌能力，降低细菌负荷，并在糖尿病小鼠模型中提高生存率、减少器官脓肿、保护组织结构。文章系统性地结合了体外流式细胞术、显微镜观察及体内动物模型，阐明了阿司匹林作为辅助疗法减轻hvKp感染中血栓炎症并发症的潜力，为糖尿病合并KPIS患者的治疗提供了新的理论依据和潜在策略。
引言
肺炎克雷伯菌（Kp）已成为全球尤其是东亚地区化脓性肝脏脓肿的主要致病菌，其引发的侵袭性感染可导致脑膜炎、眼内炎、坏死性筋膜炎等转移性并发症，统称为肺炎克雷伯菌侵袭综合征（KPIS）。该综合征的发生依赖于细菌和宿主两方面的因素。在细菌层面，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）菌株，特别是血清型K1和K2，与KPIS的发生密切相关。在宿主层面，血糖控制不佳的糖尿病（DM）是KPIS最重要的风险因素。高血糖环境会促进hvKp荚膜多糖（CPS）基因表达，增强其抵抗吞噬的能力，并削弱中性粒细胞的趋化、吞噬和杀菌功能，从而增加侵袭性疾病的风险。此外，血小板除了止血功能外，也被认为是感染和炎症的重要介质。它们与免疫细胞相互作用，形成血小板-白细胞聚集体（PLA），这些聚集体既参与宿主防御，也可能导致血栓形成。研究表明，糖尿病患者循环中PLA水平升高，与血管并发症相关。鉴于血小板活化、炎症和血栓形成在KPIS中的相互作用，抗血小板治疗（如使用阿司匹林）已被提出作为一种潜在的治疗策略，回顾性研究也显示阿司匹林可降低化脓性肝脏脓肿的发生率和复发率。然而，血小板活化、PLA形成与KPIS发病机制之间的联系，以及阿司匹林在其中所起的作用，尚未完全阐明。本研究旨在明确高血糖条件下，血小板-白细胞（特别是中性粒细胞）相互作用对KPIS的贡献，并评估阿司匹林调控这些作用的潜力。
材料与方法
研究获得了长庚纪念医院机构审查委员会（IRB）的批准。使用的细菌菌株包括从肝脓肿患者分离的具有高黏液表型的hvKp菌株KP-M1（ST23，血清型K1）及其衍生的无荚膜突变体DT-X。从健康志愿者采集全血样本，分别用于血小板活化、PNA分析和中性粒细胞分离。血小板活化通过流式细胞术检测CD61和CD62P（P-选择素）的表达进行评估，同时使用ELISA试剂盒定量血浆中的可溶性活化标志物（P-选择素、血小板因子4（PF-4）和β-血栓球蛋白（β-TG/NAP-2））。PNA形成通过流式细胞术检测CD42b+/CD11b+/CD18+三重阳性事件来评估，并使用吉姆萨染色进行显微镜观察。中性粒细胞杀菌活性通过菌落形成单位（CFU）计数来评估KP-M1的存活情况。动物实验使用C57BL/6（B6）小鼠，通过注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病。治疗组小鼠每日口服阿司匹林，对照组给予无菌水。随后通过口服灌胃感染KP-M1。感染后监测生存情况，并收集血浆和组织样本进行分析，包括血浆P-选择素ELISA、组织H&E染色评估损伤以及肝脏匀浆CFU计数以确定细菌负荷。所有数据均使用适当的统计方法进行分析。
结果
KP-M1孵育后的血小板活化
流式细胞术分析表明，与无荚膜对照菌株DT-X和DPBS对照相比，KP-M1孵育显著增加了血小板活化（CD61+/CD62P+比例升高），并且这种效应在所有测试的葡萄糖浓度下均能观察到。葡萄糖补充进一步以浓度依赖性的方式增强了KP-M1诱导的血小板活化，在0.5%葡萄糖浓度下达到最高。相反，在没有KP-M1的情况下，葡萄糖补充本身并未显著增加血小板活化。显微镜观察结果与流式结果一致，显示KP-M1处理后血小板聚集和活化形态特征在高葡萄糖浓度下更为明显。
KP-M1孵育后的PNA形成
与血小板活化并行，KP-M1孵育也显著促进了PNA的形成，表现为CD42b+/CD11b+/CD18+事件比例增加。这种效应是KP-M1特异的，DT-X或DPBS对照在任何葡萄糖条件下均未诱导出可比水平的PNA形成。葡萄糖补充进一步以浓度依赖性的方式增强了KP-M1诱导的PNA形成，在0.5%葡萄糖下达到最高水平。显微镜检查也证实了KP-M1暴露后血小板-中性粒细胞相互作用的增强。
水杨酸（SA）对血小板活性和PNA形成的影响
水杨酸（SA，阿司匹林的活性成分）被测试其对KP-M1介导的血小板活化的影响。流式细胞术显示，在0.5%葡萄糖的高血糖条件下，添加30 μg/mL SA显著降低了CD61+/CD62P+血小板比例以及P-选择素、PF-4和β-TG等活化标志物水平，表明SA有效降低了高血糖条件下KP-M1诱导的血小板过度活化。然而，尽管降低了血小板活化，SA并未减少在0.5%葡萄糖条件下的PNA形成。CFU实验表明，添加SA显著降低了在0.5%葡萄糖中KP-M1的存活数量，提示SA增强了中性粒细胞介导的细菌清除能力。
体内小鼠模型：阿司匹林在预防KP-M1诱导的侵袭性感染中的作用
在糖尿病小鼠模型中，KP-M1感染后血浆P-选择素（CD62P）水平显著升高，而阿司匹林预处理降低了这一水平，表明其能减轻感染后的血小板活化。生存分析显示，KP-M1感染显著降低了正常血糖和糖尿病小鼠的生存率，而阿司匹林预处理延长了生存时间，在糖尿病组中效果具有统计学显著性。感染糖尿病小鼠的死后检查显示肝脏和肺部有广泛的脓肿，而阿司匹林处理的糖尿病小鼠则未出现肉眼可见的脓肿，表明其对组织损伤具有保护作用。肝脏组织病理学也证实了阿司匹林预处理能更好地保护肝脏结构，半定量评分显示其显著降低了感染引起的肝损伤。此外，肝脏匀浆CFU计数显示，未使用阿司匹林的感染糖尿病小鼠细菌负荷最高，而阿司匹林预处理显著降低了正常血糖和糖尿病小鼠的肝脏细菌负荷。
讨论
本研究探讨了高血糖条件下KPIS中的血小板-中性粒细胞相互作用，并评估了阿司匹林调节hvKp感染的治疗潜力。高血糖会加剧hvKp诱导的血小板活化、增加PNA形成并促进细菌存活，表明高血糖加剧了hvKp驱动的免疫失调并促进KPIS。血小板除了参与止血，还在炎症和感染反应中扮演更广泛的角色，它们与中性粒细胞相互作用形成PNA，这些聚集体可能通过促进内皮黏附、产生活性氧和形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来捕获病原体，但也可能导致组织损伤和血栓形成。这与先前观察到的KPIS患者，特别是血糖控制不佳者，血栓并发症风险增加的现象一致。
阿司匹林对血小板活化的抑制作用已很明确，但其对PNA形成的影响更为复杂。本研究发现SA虽然降低了血小板活化标志物，但并未减少高血糖条件下的PNA形成，这表明阿司匹林可能直接影响PNA内的中性粒细胞活性，而非仅通过血小板起作用。这揭示了血小板-中性粒细胞相互作用在免疫和病理中的双重作用。尽管如此，阿司匹林在体外和体内均显示出增强中性粒细胞活性、降低细菌负荷、改善糖尿病小鼠生存率以及减轻器官损伤的效果。
研究建立的高血糖体外模型成功再现了hvKp感染的关键方面，为机制研究提供了可重复的平台。而采用口服灌胃感染的糖尿病小鼠模型，则更好地模拟了临床相关感染途径，重现了KPIS的多器官受累特征。
本研究也存在一些局限性。例如，SA未能抑制PNA形成，其具体机制尚不清楚。研究仅评估了阿司匹林，未涉及其他抗血小板药物。此外，未进行评估阿司匹林反应性的花生四烯酸刺激试验。可溶性P-选择素并非完全血小板特异性，但β-TG、PF4和可溶性P-选择素结果一致，支持了血小板活化增强的结论。
结论
本研究证明hvKp能显著增加血小板活化和PNA形成，而高血糖会进一步放大这些效应。阿司匹林的应用降低了血小板活化、减少了细菌存活率，并改善了hvKp感染糖尿病小鼠的生存率。这些结果突显了高血糖、血小板活化和免疫失调在KPIS中的紧密联系，并支持阿司匹林作为一种潜在的辅助疗法，用于减轻hvKp感染中的血栓炎症并发症。
