《Emerging Microbes & Infections》：Receptor binding domain-independent pancoronavirus vaccine design by fusion of conserved T/B Epitopes
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本综述介绍了一种创新的泛冠状病毒（Pancoronavirus）疫苗设计策略。该研究突破了传统针对受体结合域（RBD）的设计局限，通过筛选鉴定出在多种人感染冠状病毒刺突（S）蛋白中高度保守的T细胞（VV）和B细胞（VS）表位长肽，并创新性地将其与S2亚基的七肽重复序列1/2（HR1/HR2）三聚体支架蛋白进行结构融合，构建了HR1-VV-HR2-VS融合蛋白免疫原。此设计在小鼠模型中成功诱导了优于单一肽组分的强大细胞与体液免疫应答，并对HCoV-229E、SARS-CoV-2原型株及KP.2变异株的攻击展现出显著的交叉保护效力，为开发下一代通用型冠状病毒疫苗提供了有力的概念验证和极具前景的技术平台。
引言：开发泛冠状病毒疫苗的紧迫性与新策略
尽管世界卫生组织（WHO）已宣布SARS-CoV-2不再构成国际关注的突发公共卫生事件，但病毒的持续传播和进化仍带来流行病学不确定性。早期疫苗主要针对刺突（S）蛋白的免疫优势区域，特别是受体结合域（RBD），但这些区域的突变积累导致了免疫逃逸，从而降低了基于原型株疫苗的效力。因此，开发针对保守表位的泛冠状病毒疫苗对于疫情控制至关重要。
当前广谱冠状病毒疫苗的设计策略主要有两种：一是靶向保守的S蛋白结构域（如HR121和HR1LS疫苗）；二是旨在引发协同B细胞和T细胞应答的多表位疫苗（如UB-612和RBD-HLA-EP疫苗）。然而，基于RBD的策略可能加速免疫逃逸，因此需要靶向更稳定的病毒区域。下一代疫苗中保守B细胞和T细胞表位的协同作用可能克服当前限制。
开发有效的T/B细胞表位疫苗面临两个主要挑战：HLA限制和次优免疫原性。研究表明，合成多肽（SLPs）比最小表位肽能诱导更强的抗原特异性CD8+T细胞反应。更重要的是，多肽设计能够整合多个表位，从而拓宽HLA覆盖范围。基于这些原理，本研究设计了一个独特的疫苗平台，将保守的T/B细胞表位结构整合到七肽重复序列1-七肽重复序列2（HR1-HR2）三聚体支架蛋白中。
保守T/B细胞表位区域的鉴定
MHC的多态性是限制多肽疫苗保护效力的因素之一。根据免疫表位数据库（IEDB），HLA-A02:01等位基因在全球HLA-A亚型中分布频率较高。为鉴定SARS-CoV-2 S蛋白的免疫优势T细胞表位，我们基于IEDB数据库绘制了HLA-A02:01限制性CD8+T细胞表位图谱。同样，也绘制了S蛋白的B细胞线性表位图谱。
值得注意的是，S1269-277和S2976-1008中的CD8+T细胞表位呈现出高免疫原性，而S3809-824和S41142-1170中的B细胞线性表位呈现强反应性。随后的比较序列分析发现，S2976-1008（命名为VV长肽）和S41142-1170区域是冠状病毒S蛋白中进化上保守的结构域。前期研究已证实P4肽（S1139-1170aa）含有中和抗体表位，S1129-1145肽也被证实含有B细胞抗原表位。因此，我们将扩展的S1129-1170区域命名为VS长肽。结构分析展示了它们在S蛋白中的保守模式和结构位置。IEDB分析在VV/VS区域中鉴定出了HLA结合的CD8+T细胞表位和鼠源MHC-I反应性表位。结果表明，VV肽含有一个交叉反应表位，而VS含有两个具有人/鼠双MHC-I结合能力的表位。基于这些特征，我们合成了五个VV衍生（SP1-SP5）和两个VS衍生（SP6-SP7）肽段进行验证。计算模型预测这些表位可提供94%的全球人群覆盖率。
候选长肽在COVID-19康复者PBMC中诱导特异性T细胞免疫应答
为了从功能上表征保守VV和VS长肽的免疫原性，我们使用从16名COVID-19康复期供者分离的外周血单核细胞（PBMCs）进行了离体刺激实验。细胞因子微球阵列分析显示，用VV肽池刺激显著增强了IFN-γ和TNF-α的分泌，而VS肽池主要增强了IFN-γ和IL-2的分泌。此外，用VS长肽刺激显著促进了Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-2）的协同分泌。
我们通过流式细胞术进一步量化了刺激后PBMC中活化诱导标记物（AIM）阳性T细胞亚群的比例。定量分析显示，在用VS肽池和VV肽池刺激后，AIM+CD8+T细胞和AIM+CD8+效应记忆T细胞（Tem）的比例均显著增加。此外，用VV长肽或VS肽池刺激也显著增加了AIM+CD4+T细胞和AIM+CD4+Tem细胞的比例，证实了这些肽段强大的免疫刺激能力。这些结果证明VV和VS长肽能够有效引发COVID-19康复者中广泛反应的特异性T细胞免疫。
多肽融合蛋白HR1-VV-HR2-VS可形成具有高热稳定性的三聚体构象
为增强免疫原性，我们通过将VV和VS肽段整合到保守的HR1-HR2支架中，设计出了HR1-VV-HR2-VS融合蛋白。HR1-HR2是关键的膜融合结构域，也是有前景的通用冠状病毒疫苗靶点。使用AlphaFold2预测了该融合蛋白的三聚体结构，并且两种融合蛋白均成功在哺乳动物细胞中表达和纯化。
SDS-PAGE分析显示，两种融合蛋白的条带表观分子量均大于理论预测值，提示可能存在糖基化。这一假设随后通过去糖基化及SDS-PAGE分析得到证实。该观察结果与尺寸排阻色谱和分析型超速离心分析结果一致，后者测得的分子量比预期的三聚体组装体分子量高出30-36%。交联分析证实了三聚体组织形式，同时也检测到单体和二聚体群体，后者可能是由于交联不完全所致。圆二色光谱分析显示，该蛋白主要为α-螺旋结构，并具有高热稳定性。综上所述，以上生化数据表明HR1-VV-HR2-VS和HR1-HR2蛋白在溶液中主要采取三聚体形式。
免疫接种HR1-VV-HR2-VS融合蛋白诱导更强的抗原特异性T细胞免疫
在C57BL/6野生型（WT）和HLA-A02:01转基因小鼠中，系统比较了HR1-VV-HR2-VS与单独的VV/VS肽段的免疫原性。融合蛋白免疫在野生型小鼠中，针对其组成表位（SP1-4, SP6-7）诱导了显著强于多肽免疫的IFN-γ+T细胞反应。虽然HLA-A02:01转基因小鼠由于HLA限制性表现出更局限的反应，但对于特定表位（SP1, SP6-7）仍观察到增强的IFN-γ产生，且HR1-VV-HR2-VS免疫组的反应优于多肽对照组。此外，HLA-A*02:01转基因小鼠表现出比野生型更高的IFN-γ+T细胞频率。
同样，对HR1/HR2结构域表位（SP8-13）的比较分析显示，HR1-VV-HR2-VS免疫比单独的HR1-HR2支架增强了IFN-γ+T细胞反应。野生型小鼠对SP10和SP12-13的反应显示出显著更高的倍数增加，而SP11反应在HLA-A*02:01转基因小鼠中更高，这证明了融合设计在增强插入表位和支架衍生表位反应方面的双重优势。
免疫接种HR1-VV-HR2-VS融合蛋白诱导更强的生发中心反应
为了评估抗体介导的免疫，我们量化了免疫后野生型和HLA-A*02:01转基因小鼠脾淋巴细胞中的生发中心（GC）B细胞和滤泡辅助性T细胞（Tfh）。结果显示，在野生型小鼠中，与PBS组、单独的CpG/Al(OH)?佐剂组、单独的VV或VS长肽免疫组相比，HR1-VV-HR2-VS免疫组均表现出显著增加的GC B细胞和Tfh细胞比例。
与野生型小鼠一致，免疫HR1-VV-HR2-VS的HLA-A02:01转基因小鼠与PBS对照组相比，也表现出显著升高的GC B细胞和Tfh细胞频率。值得注意的是，免疫HR1-VV-HR2-VS的野生型小鼠脾淋巴细胞中GC B细胞和Tfh细胞的频率显著高于HLA-A02:01转基因小鼠。分析表明，尽管HR1-HR2支架是驱动生发中心反应的主要因素，但肽段的整合起到了协同增强免疫反应的作用，凸显了基于融合的设计方案的优越效力。
免疫接种HR1-VV-HR2-VS融合蛋白诱导更强的体液免疫
对免疫小鼠血清的体液免疫分析显示，在野生型小鼠中，HR1-VV-HR2-VS和HR1-HR2疫苗配方诱导的抗原特异性抗体滴度显著高于HLA-A*02:01转基因小鼠。出乎意料的是，单独的VS肽免疫未能通过ELISA检测到抗体。然而，使用IFA佐剂的VS肽（免疫程序）显示出较低但可检测的VS特异性IgG滴度，这表明单独的肽段免疫原性欠佳，需要佐剂优化。此外，HR1-VV-HR2-VS融合蛋白表现出更优的免疫原性，诱导的VS特异性抗体滴度是单独VS肽的6.8倍（野生型）和1.3倍（转基因型）。
用VS、HR1-HR2或HR1-VV-HR2-VS抗原免疫的小鼠血清，相对于单独的佐剂对照组，对SARS-CoV-2原型假病毒表现出显著的中和活性。虽然用VS肽或HR1-HR2免疫的小鼠血清对Omicron B.1.1.529的中和作用减弱，但HR1-VV-HR2-VS组保持了相当的效力。这些结果表明HR1-VV-HR2-VS抗原可能诱导具有更广泛交叉反应活性的中和抗体。
在293T细胞膜上表达冠状病毒S蛋白会通过与相邻293T细胞上表达的ACE2特异性结合诱导合胞体形成。HR1-VV-HR2-VS组的血清显示出对SARS-CoV-2原型株、Omicron B.1.1.529和HCoV-NL63广泛的融合抑制作用，表明其具有广泛的融合阻断能力。来自HR1-VV-HR2-VS免疫的野生型小鼠的血清，与单独的佐剂组相比，表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）活性增强。与生发中心反应一致，血清抗体的融合抑制活性主要由HR1-HR2支架蛋白介导，而VS长肽则提供了额外的增强作用。
HR1-VV-HR2-VS疫苗对小鼠活冠状病毒攻击提供优异保护
考虑到CpG/Al(OH)?组合的佐剂效力有限，我们进一步引入了Montanide ISA 720VG（一种临床上比IFA更安全的替代品）并评估了其在小鼠中的保护性免疫原性。所有免疫均采用ISA 720VG佐剂的配方肌肉注射进行，以保持实验一致性。
用HR1-VV-HR2-VS免疫的小鼠，采用双次接种方案，经鼻攻击HCoV-229E。HR1-VV-HR2-VS免疫防止了显著的体重下降，将肺部病毒载量降低了58-65%，并减轻了肺部病理变化（包括明显的炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚），显示出优于单独佐剂对照组的保护效力。
基于其优异的保护效力，选择Montanide ISA 720VG作为后续SARS-CoV-2攻击研究的佐剂。K18-hACE2转基因小鼠先用灭活疫苗初免，然后用候选疫苗加强免疫两次。末次免疫后两周，小鼠经鼻攻击SARS-CoV-2原型株（Wuhan-Hu-1）或KP.2变异株，并在感染后4天评估病毒载量和病理变化。HR1-VV-HR2-VS加强免疫显示出优异的保护作用，与PBS和灭活疫苗对照组相比，分别将肺部病毒载量降低了76%和79%（针对原型株），以及64%和36%（针对KP.2变异株）。单剂灭活疫苗将KP.2病毒载量降低了43%，但对原型株无保护作用，而HR1-HR2免疫分别对野生型株和KP.2株显示出47%和31%的病毒载量降低。HR1-VV-HR2-VS疫苗接种显著减轻了肺部病理变化，与对照组相比，减少了炎性细胞浸润并保留了肺泡结构。综上所述，这些数据表明HR1-VV-HR2-VS加强免疫可针对多种冠状病毒，包括SARS-CoV-2原型株、KP.2变异株和异源的HCoV-229E，提供广泛的保护。
讨论
通过比较七种人类冠状病毒和SARS-CoV-2变异株的刺突蛋白，我们鉴定出两个保守且免疫优势的表位：VV（T细胞）和VS（B细胞），并通过COVID-19康复者PBMC验证。随后，我们利用SARS-CoV-2天然的HR1-HR2三聚化机制，设计了HR1-VV-HR2-VS融合蛋白。用该构建体免疫，与单独的肽段相比，增强了T细胞反应和VS特异性体液免疫，同时在小鼠模型中显示出对SARS-CoV-2原型株、KP.2变异株和HCoV-229E攻击的交叉保护效力。
针对保守T/B细胞表位的表位聚焦疫苗在开发广谱保护性冠状病毒疫苗方面展现出前景。CoVac-1的临床试验结果显示其能够诱导持续、耐变异株的IFN-γ反应和强大的T细胞免疫，即使在B细胞缺陷患者中也是如此。我们的表位中心疫苗设计利用进化上受限的S蛋白区域，通过含有具有94%全球HLA-I覆盖率的混杂CD8+T细胞表位的VV/VS长肽，产生持久、交叉反应的免疫力。Pereira Neto等人的研究证实，S2亚基内的保守T细胞表位区域（包括HR1结构域和VV长肽）显著增强了跨β冠状病毒的交叉反应性T细胞识别。这一发现为这些区域的广谱疫苗潜力提供了独立支持。
几种基于HR1/HR2的疫苗候选物已显示出良好的免疫原性和保护效力。例如，HR121在多种动物模型中表现出强大的效力，而HR1LS则能引发广谱中和抗体。我们的数据显示，HR1-HR2免疫对小鼠KP.2变异株攻击的保护有限，这可能归因于KP.2 S蛋白HR1结构域内的关键突变（S939F, Q954H, 和 N969K）。比较分析显示，与HR1-HR2构建体相比，HR1-VV-HR2-VS融合肽对Omicron KP.2攻击表现出显著增强的保护效力，显示出显著更低的病毒载量和减轻的肺部病理。这种保护优势表明，整合的VV/VS长肽在功能上与核心HR1-HR2结构域协同作用，以拓宽免疫识别。观察到的对异源HCoV-229E感染的交叉保护进一步证实了这种协同作用。我们的研究结果表明，与仅包含HR1和HR2结构域的构建体相比，HR1-VV-HR2-VS融合蛋白表现出显著增强且更广泛的保护效力。我们的研究建立了一种将保守T/B细胞表位与HR1-HR2支架融合作为新型疫苗抗原的创新方法。该设计成功引发并发的体液和细胞免疫，标志着从表位定位到功能性抗原设计的概念转变，以开发广谱多肽疫苗。
COVID-19患者血清对异源HCoV S2结构域表现出交叉反应性，支持其作为泛冠状病毒疫苗靶点的潜力。然而，S2亚基引发的中和抗体反应有限，这反映在HR1-VV-HR2-VS免疫后观察到的病毒清除不完全和适中的中和抗体滴度上。因此，靶向S2的疫苗高度依赖佐剂选择以获得最佳免疫原性。CF501佐剂在HR1LS疫苗接种中被证明比铝佐剂诱导更高的中和抗体滴度，这与我们的发现一致，即弗氏佐剂增强了VS肽特异性体液免疫。未来的工作将通过佐剂和递送系统评估来优化此平台。
我们观察到野生型与HLA-A02:01转基因小鼠对肽段SP2-4和SP10-12的T细胞反应存在差异。这些差异可能涉及HLA限制性和结合亲和力的变化。例如，SP4表位不结合HLA-A02:01。此外，SP3、SP10和SP13中的表位被预测为弱结合。另一个因素可能是刺激肽与抗原呈递细胞自然加工的多肽不匹配。这种不匹配可能是导致对SP2和SP12中HLA-A02:01结合表位缺乏显著反应的原因。此外，与野生型对照相比，HLA-A02:01转基因小鼠表现出减弱的生发中心反应和体液反应，这可能是由于人β-2微球蛋白替代损害了FcRn介导的IgG保护作用。这导致了IgG分解代谢加速，并在相同时间点产生显著低于野生型小鼠的抗原特异性抗体滴度。另外，在野生型小鼠中，VS肽免疫显著降低了Tfh细胞频率，这可能是由IL-2介导的Tfh分化抑制所导致。与此机制一致，VS长肽和肽池在人类PBMC中均能有效刺激IL-2产生。
尽管如此，本研究有两个主要局限：尽管病毒载量显著降低，但仍观察到不完全的病毒清除；并且未评估粘膜免疫。未来的工作将优化佐剂配方，特别是TLR激动剂和STING激活剂，以增强全身和粘膜保护。
总而言之，我们的研究引入了一种合理的疫苗设计，它基于两个协同组成部分：保守高效T/B细胞表位的战略性整合，以及发挥双重作用的HR1/HR2支架。该支架蛋白不仅强有力地增强了这些表位的免疫原性，还同时提供了独立的保护性免疫力。该策略有效地超越了最小表位疫苗的局限性，并为广谱保护建立了一个多功能平台。
