《Emerging Microbes & Infections》：An Rv1471-Expressing Chimpanzee Adenovirus Vaccine Confers Protection Against Tuberculosis by Inducing Alveolar Macrophage Trained Immunity and Polyfunctional T-Cell Responses
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本文研究了一款新型结核病疫苗rAd-Rv1471。该疫苗通过黑猩猩腺病毒载体递送结核分枝杆菌抗原Rv1471，采用鼻内免疫方式，在小鼠模型中成功诱导了肺泡巨噬细胞的训练免疫状态，同时引发了强烈的抗原特异性多能性T细胞反应。研究发现，该双重免疫策略不仅提升了巨噬细胞的自主抗分枝杆菌能力，还显著增强了小鼠对结核分枝杆菌气溶胶攻击的保护力，其作为BCG（卡介苗）疫苗的异源加强针也能有效提升保护效果。这项工作为通过靶向先天免疫记忆的黏膜疫苗策略研发下一代结核病疫苗提供了新的思路。
文章内容归纳总结
1. 引言
结核病（TB）作为由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的慢性传染病，依然是全球最致命的单一致病菌相关疾病。目前唯一获批的百年老疫苗卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）虽然在儿童中具有较强保护效力，但在青少年及成人中的效果差异巨大（0% - 80%），且重复接种无法增强保护力，其对全球结核病流行的控制效果有限。因此，开发新的结核病疫苗策略至关重要。肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages, AMs）是肺部抵御吸入性病原体的第一道防线，其功能状态对早期感染结局具有决定性作用。近年来，“训练免疫”概念的提出表明，先天免疫细胞也能在刺激下形成长期的功能性重编程，从而在面对二次感染时产生更强更快的保护性反应。基于此，本研究团队将目光投向了能够诱导巨噬细胞先天免疫记忆的结核分枝杆菌抗原Rv1471，并利用能够诱导肺泡巨噬细胞自主记忆的黑猩猩腺病毒载体，开发了一种新型鼻内黏膜疫苗rAd-Rv1471，旨在同时激活肺泡巨噬细胞的训练免疫和适应性T细胞免疫，实现对结核病的协同防御。
2. rAd-Rv1471的构建与验证
研究团队将结核分枝杆菌H37Rv菌株的抗原基因Rv1471克隆至复制缺陷型黑猩猩腺病毒26型载体中，构建了重组腺病毒疫苗rAd-Rv1471。通过桑格测序验证了重组腺病毒的正确组装。在HEK 293A细胞中包装并纯化病毒后，利用抗Rv1471血清进行Western Blot分析，证实了重组病毒能够有效表达Rv1471蛋白。此外，还通过SWISS-MODEL服务器预测了Rv1471蛋白的三维结构，为后续功能研究提供了结构基础。
3. 鼻内接种rAd-Rv1471诱导肺泡巨噬细胞训练免疫
为了评估rAd-Rv1471诱导训练免疫的能力，研究建立了小鼠体内训练免疫模型。小鼠经鼻内接种PBS、空白腺病毒载体（Ad）或rAd-Rv1471，28天后分离肺泡巨噬细胞进行功能分析。
实验结果表明，与PBS组相比，Ad载体本身就能诱导肺泡巨噬细胞产生一定程度的训练免疫，表现为在热灭活结核分枝杆菌或脂多糖刺激下，促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌显著增强。而接种rAd-Rv1471则能进一步放大这种效应，使TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平显著高于Ad组。
流式细胞术分析显示，rAd-Rv1471训练后的肺泡巨噬细胞表面MHC II分子和共刺激分子CD86的表达上调，细胞增殖标志物Ki67的表达也增加，表明细胞处于一种激活和准备状态。同时，细胞内TNF-α和IL-6的分泌水平也显著升高。单细胞层面的UMAP降维分析进一步确认，rAd-Rv1471训练组的肺泡巨噬细胞中，高表达MHC II和TNF-α的细胞亚群比例显著增加。
重要的是，研究人员构建了表达另一个结核分枝杆菌抗原Rv2299c的对照腺病毒rAd-Rv2299c，发现其并不能像rAd-Rv1471那样增强肺泡巨噬细胞的训练免疫反应，这凸显了Rv1471抗原在诱导训练免疫方面的特异性。
4. rAd-Rv1471增强肺泡巨噬细胞自主抗分枝杆菌活性
为了探究rAd-Rv1471诱导的训练免疫是否依赖于其他免疫细胞，研究建立了体外肺泡巨噬细胞训练免疫评价模型。从初始小鼠中分离肺泡巨噬细胞并在体外扩增，然后用PBS、Ad或rAd-Rv1471进行训练。
结果显示，体外训练的结果与体内实验一致：rAd-Rv1471训练能显著增强肺泡巨噬细胞在HK Mtb或LPS再刺激下TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。转录组测序分析表明，rAd-Rv1471训练后的肺泡巨噬细胞中，编码炎症细胞因子、趋化因子以及抗原呈递和吞噬相关关键分子的基因表达上调。
最关键的功能性实验证明，与未训练的对照组相比，经Ad训练的肺泡巨噬细胞对活BCG和结核分枝杆菌的细胞内清除能力在感染后48小时显著增强。而rAd-Rv1471训练则能带来更高水平的细菌清除效果。通过感染表达绿色荧光蛋白的BCG并观察荧光强度，也直观地证实了rAd-Rv1471训练组肺泡巨噬细胞内细菌负荷的降低。这些数据表明，rAd-Rv1471通过训练免疫，以不依赖于其他细胞的方式，增强了肺泡巨噬细胞自主的内在抗分枝杆菌防御能力。
5. rAd-Rv1471诱导训练免疫的转录组学特征
为了阐明rAd-Rv1471诱导训练免疫的分子机制，研究人员对体外训练后静息5天的肺泡巨噬细胞进行了Smart-seq2 RNA测序。
主坐标分析显示，不同训练组的肺泡巨噬细胞具有截然不同的转录谱。基因本体生物过程富集分析表明，rAd-Rv1471训练组上调的基因通路主要与刺激反应和先天免疫反应过程相关。京都基因与基因组百科全书通路分析进一步揭示了经典炎症信号通路的显著富集，如ErbB、TGF-β、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB和TNF信号通路，以及与先天免疫反应相关的通路，如白细胞跨内皮迁移、Toll样受体信号、NOD样受体信号、趋化因子信号和C型凝集素受体信号通路。
尤为关键的是，与巨噬细胞训练免疫诱导密切相关的通路，如糖酵解和Akt/mTOR/HIF-1α信号通路，在Ad和rAd-Rv1471组中均被显著激活。其中，rAd-Rv1471组在Akt/mTOR/HIF-1α信号通路上的激活水平显著高于Ad组。通过Seahorse能量代谢分析仪进行的代谢谱分析也证实，rAd-Rv1471和Ad对增强糖酵解活性具有相似的效果。定量PCR进一步验证了RNA测序的结果，Tnfα、Il6、Il1b、Mtor、Akt、Nfκb、Hif1α和Nod1等关键基因的表达在rAd-Rv1471组均显著上调。
综上所述，这些结果表明rAd-Rv1471通过转录重编程，在肺泡巨噬细胞中建立了一种训练状态，增强了其对二次挑战的免疫代谢反应。
6. rAd-Rv1471诱导强大的抗原特异性T细胞免疫应答
研究进一步评估了rAd-Rv1471作为疫苗在小鼠模型中的免疫原性。小鼠经鼻内接种后第28天，分析肺和脾脏中的T细胞反应。
流式细胞术分析发现，与PBS和Ad对照组相比，rAd-Rv1471疫苗接种显著增加了肺部和脾脏中Rv1471特异性Th1和Th17 CD4? T细胞以及细胞毒性CD8? T细胞亚群的频率。在Rv1471或HK Mtb刺激下，这些T细胞亚群分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-17的能力也显著增强。
多功能性分析进一步证明，在rAd-Rv1471免疫的小鼠肺部，双阳性（如TNF-α?IL-2?、TNF-α?IL-17?、IFN-γ?IL-17?）和单阳性（TNF-α?、IFN-γ?、IL-2?、IL-17?）的CD4? T细胞亚群比例扩大。CD8? T细胞也显示出类似的多功能性比例增加。这些发现表明，rAd-Rv1471疫苗能在小鼠疫苗接种模型中引发强大的抗原特异性多功能性T细胞反应。
7. rAd-Rv1471赋予小鼠抗结核分枝杆菌感染的保护力
为直接评估疫苗的保护效力，免疫后4周的小鼠通过气溶胶感染结核分枝杆菌。
结果显示，与仅接种Ad载体的小鼠相比，接种rAd-Rv1471的小鼠肺部和脾脏中的细菌负荷显著降低。Ad载体本身仅能略微降低脾脏的细菌负荷。肺组织病理学分析表明，rAd-Rv1471免疫显著改善了感染引起的炎症病理变化，如淋巴细胞、巨噬细胞和粒细胞浸润、肺泡壁增厚和出血灶等。对炎症浸润面积的定量评估进一步支持了rAd-Rv1471的保护作用。
考虑到BCG在成人中复种效果有限，研究还评估了rAd-Rv1471作为BCG初免后的异源加强针的效果。与仅接种BCG的小鼠相比，BCG初免后再用rAd-Rv1471加强免疫，能在结核分枝杆菌攻击后进一步降低细菌负荷。尽管在减轻炎症浸润方面也观察到改善趋势，但与单独BCG组相比未达到统计学显著性。
综上所述，这些结果表明rAd-Rv1471既能作为独立的疫苗，也能作为BCG的加强针，有效增强小鼠的抗结核保护。
8. rAd-Rv1471增强结核分枝杆菌感染后的回忆性T细胞应答
研究评估了结核分枝杆菌攻击后的回忆性免疫。结果显示，与对照组相比，rAd-Rv1471免疫的小鼠在PPD刺激下，其肺来源的CD4?和CD8? T细胞产生TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-17的水平均升高。
多功能性分析显示，双阳性CD4? T细胞亚群（TNF-α?IFN-γ?、TNF-α?IL-2?、IFN-γ?IL-2?）和单阳性亚群（TNF-α?、IFN-γ?、IL-2?）的比例扩大，CD8? T细胞中也观察到相应的双阳性和单阳性亚群增加。此外，感染后rAd-Rv1471免疫组肺中CD4?和CD8? T细胞的比例显著增加。表型分析发现，rAd-Rv1471训练与中央记忆T细胞比例减少、效应记忆T细胞、终末分化效应记忆T细胞和初始T细胞亚群比例增加相关。
因此，研究人员推测，rAd-Rv1471可能通过促使T细胞优先分化为效应表型，从而为肺部T细胞快速、多功能性的抗结核分枝杆菌回忆应答做好了准备。
9. 讨论
本研究首次将能够诱导训练免疫的结核分枝杆菌抗原Rv1471与能够靶向肺部并诱导肺泡巨噬细胞自主记忆的黑猩猩腺病毒载体相结合，开发了新型黏膜疫苗rAd-Rv1471。该疫苗成功地在肺泡巨噬细胞中诱导了强大的训练免疫状态，其特征是促炎细胞因子分泌增强、抗原呈递能力提升以及细胞自主抗分枝杆菌活性提高。同时，它还引发了强烈的抗原特异性多功能性T细胞应答。
与空白腺病毒载体相比，rAd-Rv1471显著放大了训练免疫表型。然而，单独激活肺泡巨噬细胞并不足以对抗像结核分枝杆菌这样复杂的病原体。控制早期结核分枝杆菌感染需要肺泡巨噬细胞与组织驻留抗原特异性T细胞免疫反应之间的相互作用。本研究支持一个时空协同模型：鼻内接种rAd-Rv1471疫苗，能在感染的首要门户——肺部，快速建立肺泡巨噬细胞的“训练警戒”状态，增强早期细菌控制；同时，它在肺部播下抗原特异性、多功能性记忆T细胞的种子。当遭遇结核分枝杆菌攻击时，这些训练后的肺泡巨噬细胞能更有效地处理和呈递抗原，从而加速共存T细胞库的再激活。这种协调的双层反应为观察到的卓越保护力提供了合理的机制解释。
本研究的策略相较于其他疫苗平台具有独特优势。黏膜接种的腺病毒载体能直接靶向肺部驻留的先天免疫细胞，建立高度警戒状态。与主要通过系统递送刺激适应性免疫的佐剂蛋白亚单位疫苗相比，该策略能实现更快速的应答。此外，与mRNA或其他核酸平台相比，病毒载体已被证明能更有效地触发髓系细胞中持久训练免疫所特有的代谢和表观遗传重编程。
考虑到新生儿BCG疫苗接种已在大多数结核病高负担国家实施，rAd-Rv1471最具战略意义的应用是作为异源黏膜加强针。这种方法直接针对BCG在青少年和成人中效力不一的局限性，通过特异性增强肺部驻留的训练免疫和T细胞记忆来提升保护。因此，该平台并非旨在取代BCG，而是增强它，为高风险人群提供针对性的保护策略。
当然，本研究也存在一些局限性。首先，小鼠模型无法完全模拟人类结核病的免疫和病理复杂性。其次，虽然rAd-Rv1471可能协同肺泡巨噬细胞和T细胞记忆，但这种相互作用需要通过共培养系统或过继转移模型进一步验证。第三，将rAd-Rv1471与免疫优势结核分枝杆菌抗原（如ESAT-6、TB10.4、Ag85A/B）组合成多价疫苗，可能通过共同激活训练免疫和适应性免疫来扩大保护范围。
总之，本研究将rAd-Rv1471确立为一种整合肺泡巨噬细胞训练与多功能性T细胞应答的双靶向疫苗，为结核病控制提供了一种协同策略。这些发现强调了将肺泡巨噬细胞训练免疫纳入下一代疫苗理性设计的转化潜力。
10. 材料与方法
研究详细描述了重组腺病毒的构建、肺泡巨噬细胞的分离与纯化、体内外训练免疫模型的建立、酶联免疫吸附试验、肺泡巨噬细胞抗分枝杆菌活性评估、小鼠体内保护效力评估、单细胞悬液制备、组织病理学染色、流式细胞术、糖酵解速率测定、定量PCR、Smart-RNA测序以及统计学分析等实验方法。所有动物实验均遵循上海公共卫生临床中心实验动物伦理委员会的指南并获得批准。本研究得到了多项国家及地方科研基金的资助。
