类风湿性关节炎滑膜中具有独特极化的巨噬细胞自噬增加

《Autophagy》：Increased macrophage autophagy with unique polarization in rheumatoid synovium

本研究首次系统揭示类风湿性关节炎（RA）滑膜中巨噬细胞自噬活性显著增强，并鉴定出一种共表达M1/M2样标志（如CD86+MRC1+NOS2+CD163+）的独特巨噬细胞亚群（M1/M2样），其自噬相关分子表达水平最高。该发现将巨噬细胞表型极化与自噬通路紧密关联，提示自噬可能在调节RA炎症与组织修复平衡中发挥关键作用，为靶向自噬-巨噬轴治疗RA提供了新视角。

　　

Introduction

类风湿性关节炎（RA）是一种影响约1%人口的慢性炎症性全身性疾病，主要特征为滑膜炎和关节破坏。巨噬细胞在RA的发病机制中起着至关重要的作用。自噬（autophagy）是维持细胞内稳态的关键过程，但其在巨噬细胞极化中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨RA滑膜中自噬相关分子的表达和巨噬细胞表型。

Results

Evaluation of synovitis by Krenn classification

使用Krenn组织学评分系统（0-9分）评估滑膜炎严重程度。RA（n=19）滑膜组织的评分（5.8±2.0）显著高于骨关节炎（OA， n=21， 2.5±1.1）和低炎症滑膜（LIS， 髋部骨折患者， n=4， 0.25±0.4），表明RA存在显著的炎症反应。

Observation of ultrastructural morphology by electron microscopy

透射电子显微镜观察显示，RA滑膜组织中巨噬细胞样滑膜A细胞和内膜巨噬细胞内存在丰富的自噬相关结构，如早期自噬迹象（胞质内隔离）、含有细胞质物质和细胞器的双膜囊泡（自噬体样结构）以及大的吞噬泡样囊泡。相比之下，OA滑膜组织主要由成纤维细胞样滑膜B细胞组成，自噬结构较少见。

Immunohistochemical analysis

通过免疫组化分析自噬相关分子（ATG3， ATG5， LC3B， WIPI2， BECN1， ATG16L1， LAMP1， SQSTM1）在滑膜中的表达。结果显示，与OA和LIS相比，RA滑膜（包括滑膜衬里层和衬里下层基质）中所有检测的自噬相关分子表达均显著更高。双重免疫荧光染色显示，这些自噬相关分子信号（红色）在CD68⁺巨噬细胞（绿色）中频繁共定位，而在CD248/TEM-1⁺成纤维细胞样滑膜B细胞（绿色）和基质成纤维细胞中则较少。

免疫电子显微镜分析在RA组织的巨噬细胞样滑膜A细胞和巨噬细胞的囊泡膜上观察到自噬相关分子ATG5的阳性信号。

对CD68⁺巨噬细胞的定量分析显示，RA滑膜衬里层和衬里下层基质中CD68⁺细胞的比例和荧光面积百分比均显著高于OA和LIS。

通过双重免疫荧光染色分析巨噬细胞表型。在RA增生的滑膜中，观察到NOS2/iNOS⁺（M1样）巨噬细胞、CD163⁺（M2样）巨噬细胞，以及同时表达NOS2⁺和CD163⁺表型的巨噬细胞（M1/M2样）。CD163⁺巨噬细胞主要分布在增生的滑膜衬里层及其附近，而NOS2⁺巨噬细胞则倾向于分布在更深的层次。与OA和LIS样本相比，RA滑膜组织中这些双阳性巨噬细胞在滑膜衬里层的存在显著更高，在衬里下层基质中也呈现更多趋势。

使用CD86（M1样标志）和MRC1/CD206（M2样标志）的双重染色也证实了RA滑膜中存在CD86⁺MRC1⁺双阳性巨噬细胞（M1/M2样），且其在RA中的存在显著高于OA。MERTK⁺（M2样）巨噬细胞在RA滑膜中的分布与CD163⁺相似。

Western blot analysis

蛋白质印迹分析显示，自噬相关蛋白ATG16L1、BECN1和LC3B的表达水平在RA中最高，OA次之，LIS最低，与滑膜炎严重程度呈正相关。

Flow cytometry of cells isolated from synovial tissue

对从RA（n=6）、OA（n=8）和LIS（n=4）滑膜组织中分离的细胞进行流式细胞术分析。使用抗ITGAM/CD11b（泛巨噬细胞标志）、抗CD86（M1样）和抗MRC1（M2样）抗体，将ITGAM⁺细胞分为M0样（ITGAM⁺CD86^?MRC1^?）、M1样（ITGAM⁺CD86⁺MRC1^?）、M2样（ITGAM⁺CD86^?MRC1⁺）和双阳性M1/M2样（ITGAM⁺CD86⁺MRC1⁺）巨噬细胞。

在RA滑膜组织中，M1/M2样巨噬细胞占最大比例（平均53.58%），而在OA组织中，M0样巨噬细胞占主导（平均38.9%）。在LIS中，M2样巨噬细胞比RA或OA更普遍。统计分析显示，RA中M1/M2样巨噬细胞的比例显著高于OA，而OA中M0样巨噬细胞的比例显著高于RA。M1样和M2样巨噬细胞的比例在三组间无显著差异。

进一步分析自噬相关标记物（LAMP1， WIPI2， BECN1， LC3B， SQSTM1）在不同巨噬细胞表型中的表达强度（中位荧光强度， MFI）。在RA和OA中，M1/M2样巨噬细胞的各自噬标记物MFI均倾向于高于M1样或M2样巨噬细胞。特别是在RA中，LAMP1在M1/M2样巨噬细胞中的MFI显著高于M1样和M2样巨噬细胞。综合来看，M1/M2样巨噬细胞表现出最高的自噬相关分子表达水平。

Discussion

本研究发现，与成纤维细胞相比，自噬相关分子在RA滑膜的巨噬细胞中表达更为显著。研究首次比较了RA和OA滑膜中巨噬细胞表型和自噬相关标记物的表达。

在RA滑膜中，MERTK⁺和/或CD163⁺M2样巨噬细胞在增生的衬里层中丰富，而CD86⁺和NOS2⁺M1样巨噬细胞则定位于更深的衬里下层。这些表型在空间上的接近表明，即使在活动性炎症区域，也存在试图缓解炎症和组织修复的努力。

研究还通过免疫染色和流式细胞术在RA和OA滑膜中均鉴定出同时表达M1样和M2样表型的巨噬细胞（M1/M2样）。这些特征性的双阳性巨噬细胞在滑膜衬里层比在衬里下层基质中更普遍。流式细胞术鉴定出的M1/M2样巨噬细胞（CD86⁺MRC1⁺）在RA中比在OA中更普遍。值得注意的是，M1/M2样巨噬细胞在巨噬细胞亚群中显示出最高的自噬相关分子表达。这种杂交表型表明巨噬细胞表型存在一个谱系，挑战了传统的M1和M2二元分类。

在LIS组织中，M2样巨噬细胞相对丰富，而M1/M2样巨噬细胞的比例介于RA和OA之间。这些发现支持M2样巨噬细胞可能代表低炎症状态下的稳态或组织修复表型。OA中M0样巨噬细胞占主导可能反映了相对静止的巨噬细胞群体，而RA中M1/M2样巨噬细胞的增加则表明了对持续炎症反应的动态极化过程。

自噬与巨噬细胞极化在RA滑膜中密切相关。富含自噬标记物的M1/M2样巨噬细胞可能在调节炎症和组织修复中发挥抗炎作用。这些发现提示了一种RA巨噬细胞功能中潜在的自噬介导的调节机制。自噬相关通路可能代表调节RA巨噬细胞状态的潜在治疗靶点。

Materials and methods

本研究获取了19例RA患者、21例OA患者和4例髋部骨折老年患者（作为LIS对照）的滑膜组织。所有程序均符合《赫尔辛基宣言》，并获得机构伦理委员会批准及患者知情同意。

通过Krenn分类对滑膜组织进行组织学评分评估滑膜炎程度。使用透射电子显微镜观察超微结构形态。通过免疫组织化学、蛋白质印迹和流式细胞术分析自噬相关分子和巨噬细胞表型。使用针对CD68、CD248、NOS2/iNOS、CD163、CD86、MRC1、MERTK等标志物的抗体进行染色和定量分析。从滑膜组织中分离细胞，使用抗ITGAM/CD11b、CD86、MRC1抗体进行流式细胞术分析，并检测自噬相关分子（LAMP1， WIPI2， BECN1， SQSTM1， LC3B）的表达强度。统计数据以均值±标准差表示，使用Prism软件进行统计分析。