《Journal of Bacteriology》：A decade of insight into ExlA toxin research and the biotechnological potential of non-virulent Pseudomonas aeruginosa strains
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这是一篇高质量的综述，全面回顾了铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中一种重要的非T3SS毒力因子——ExlA毒素。文章系统梳理了过去十年关于ExlA毒素的发现、作用机制、调控网络以及与经典T3SS（III型分泌系统）的互斥关系，并创造性地探讨了携带exlBA基因但毒性减弱的第3、5谱系菌株在生物技术（如鼠李糖脂、绿脓菌素生产）领域的应用潜力，为开发新型抗毒力策略和绿色生物制造提供了新思路。
在对抗多重耐药细菌感染的持久战中，铜绿假单胞菌始终是一个棘手的对手。其强大的毒力与适应力，不仅对免疫功能低下患者构成严重威胁，也对全球公共卫生系统提出了严峻挑战。然而，并非所有铜绿假单胞菌都依赖相同的“武器库”来发动攻击。长期以来，研究焦点集中在主要依赖III型分泌系统（T3SS）注入效应蛋白来杀伤宿主细胞的谱系1和谱系2菌株。但近年来，另一类不携带T3SS的菌株逐渐走进科学家视野，它们主要来自谱系3和谱系5，其致病“撒手锏”是一种名为Exolysin A（ExlA）的孔道形成毒素。这篇综述旨在梳理过去十年间关于ExlA毒素的研究进展，并探讨这些毒力较弱的菌株在生物技术领域的独特价值。
EXLB-EXLA双组分系统在铜绿假单胞菌谱系3和5中的发现
ExlA毒素首次于2014年由Elsen等人在研究一株高毒力、T3SS阴性菌株铜绿假单胞菌CLJ1时报道。该菌株从一名患有慢性阻塞性肺病（COPD）并发出血性肺炎的患者体内分离得到。ExlA由exlBA操纵子编码，包含exlA（编码毒素蛋白）和exlB（编码外膜转运蛋白）两个基因。ExlB对于ExlA的分泌至关重要，其缺失会导致毒素无法分泌，细菌对宿主细胞的毒性也随之消失。基因组分析显示，在铜绿假单胞菌群体中，ExlA阳性菌株相对罕见，仅占约1%-1.5%。这些菌株主要归属于谱系3和谱系5。值得注意的是，谱系3菌株通常被认为在系统发育上较为“另类”，甚至被提议划分为一个新物种“Pseudomonas paraeruginosa”，其共同特征是缺乏T3SS基因。功能研究发现，虽然谱系3和谱系5菌株都携带exlA基因，但谱系5菌株的细胞毒性通常弱于谱系3菌株，这可能与毒素分泌效率较低有关。
EXLA介导的真核细胞损伤机制
ExlA被鉴定为一种孔道形成毒素。其C端约300个氨基酸的区域对溶血活性和识别宿主细胞膜至关重要。研究表明，ExlA形成的孔道直径约为1.6纳米，并且其活性依赖于与宿主细胞膜的紧密接触，这一过程由细菌的IV型菌毛（T4P）介导。T4P帮助细菌紧密粘附于上皮细胞和免疫细胞，从而促进毒素的有效递送。
ExlA对宿主细胞的破坏作用具有双重机制。在巨噬细胞中，它通过两种方式激活炎症小体。首先是“启动”信号，由细菌脂多糖（LPS）和鞭毛蛋白分别被跨膜受体TLR4和TLR5识别而触发，启动包括前体白细胞介素-1β（pro-IL-1β）在内的促炎细胞因子基因表达。其次，ExlA在细胞膜上形成孔道，导致细胞内钾离子（K+）外流，从而触发NLRP3炎症小体组装、caspase-1激活、IL-1β成熟以及细胞焦亡，最终释放促炎性IL-1β。
在上皮细胞和内皮细胞中，ExlA孔道形成会触发钙离子（Ca2+）内流。进入胞内的Ca2+与钙调蛋白结合，使其与ADAM10金属蛋白酶前体（pro-ADAM10）解离。随后，pro-ADAM10被弗林蛋白酶（furin）切割并激活，并被转运至质膜。活化的ADAM10会切割钙粘蛋白（cadherins），从而破坏细胞间的连接，这一过程不依赖于T4P。这些机制共同解释了感染ExlA阳性菌株（如CLJ1）为何可能导致出血性肺炎和肺组织损伤。
铜绿假单胞菌中EXLA的调控
exlBA操纵子的表达受到至少两种转录因子的精密调控。一种是Vfr蛋白（毒力因子调节子），它与环磷酸腺苷（cAMP）结合后，正向调节exlBA的转录。细胞内cAMP水平升高可增强Vfr的结合与转录活性，从而促进ExlA表达。在铜绿假单胞菌中，cAMP主要由腺苷酸环化酶CyaB合成。
另一方面，exlBA的表达也受到Exolysin调节因子A（ErfA）的负向控制。ErfA以同源二聚体形式结合在exlBA启动子区域，抑制其转录。当erfA基因失活时，会导致exlBA解除抑制，使原本无细胞毒性的菌株（如PA70）转变为高毒性表型。ErfA的C端含有一个推测的传感结构域，暗示其可能响应某种尚未鉴别的信号分子。尽管Vfr、cAMP和ErfA已被确定为关键调节元件，但ExlA调控的许多方面，特别是ErfA所感知的信号以及调控的精细环境条件，仍然未知。
T3SS与EXLA系统的关系
ExlA系统与T3SS是铜绿假单胞菌中互斥的毒力策略，目前尚未发现同时拥有两种系统的菌株。这种互斥性可能源于维持和表达两套功能重叠的分泌系统所带来的巨大能量成本。关于其进化起源，一个可能的假说是exlBA操纵子通过水平基因转移（HGT）从其他假单胞菌属物种获得。基因组分析支持这一观点，因为在一些ExlA阳性基因组中发现了残留的T3SS相关基因，暗示T3SS的丢失可能发生在获得exlBA之后。
在调控层面上，两者也存在有趣的关联与差异。在T3SS阳性菌株（如谱系1和2的PAO1、PA14）中，T3SS基因表达由转录激活子ExsA主导，而exsA的表达也受到Vfr的正向调控。在ExlA阳性菌株中，exlBA的表达同样受到Vfr的正向调控。这凸显了Vfr作为一个核心调节枢纽，在不同谱系菌株中协调着不同的毒力策略。然而，exlBA特有的负调控因子ErfA，在T3SS的调控中作用不明。这些发现表明，尽管ExlA和T3SS在进化和功能上互斥，但它们通过Vfr和cAMP信号等共享的调节元件联系在一起。
非致病性铜绿假单胞菌谱系3和5菌株的生物技术潜力
谱系3和5中一些携带exlBA操纵子但毒性减弱的菌株，为生物技术应用带来了新机遇。其毒力减弱的原因可能是ErfA的过表达抑制了exlA，或关键调控基因（如Vfr）发生突变。例如，谱系3模式菌株PA7的vfr基因发生了移码突变，导致其细胞毒性显著降低。由于它们同时缺乏关键的T3SS毒力机制，这些菌株展现出稳定且不易恢复的非致病性表型，这使其成为生产高附加值代谢产物的安全宿主。
铜绿假单胞菌能够合成多种具有应用价值的次级代谢产物，例如可用作农业抗真菌剂的绿脓菌素（pyocyanin），以及可用于化妆品和环境污染生物修复的鼠李糖脂（rhamnolipids）。然而，利用传统致病性菌株进行工业化生产存在生物安全风险。虽然已有研究尝试对模式菌株（如PAO1）进行基因组减毒改造，但完全消除毒力且不影响代谢功能的挑战巨大。
相比之下，天然存在的非致病性谱系5菌株（如ATCC 9027、CR1）展现出独特优势。它们保留了完整的代谢网络和高效的生物合成途径，能够高产目标代谢物，同时生长条件成熟、遗传操作工具完善。例如，在鼠李糖脂生产方面，尽管已尝试在恶臭假单胞菌（P. putida）和大肠杆菌（E. coli）等异源宿主中生产，但其产量仍无法与铜绿假单胞菌相比。使用非致病性的铜绿假单胞菌菌株，可以避免病原体使用的风险，同时利用其固有的高产能力。同样，在大肠杆菌中生产绿脓菌素也面临氧化应激耐受性差等问题。因此，直接利用这些天然弱毒或无毒的铜绿假单胞菌谱系3和5菌株，为安全、高效地生产这些生物分子提供了一条更具吸引力的途径。
未来方向
目前，针对谱系3和5铜绿假单胞菌的研究仍然有限。尽管已知谱系3菌株可通过分泌ExlA导致严重感染，但针对这些菌株感染的治疗方案探索不足。评估现有或新兴的抗假单胞菌疗法对这类菌株是否有效，以及开发针对所有谱系保守抗原的疫苗，是未来的重要方向。同时，深入研究同时携带T3SS和ExlA系统的菌株所承受的适应度代价，有助于理解T3SS丢失的进化驱动力。开发准确鉴定临床分离株的方法，评估不同谱系所致感染的流行病学数据，对于制定针对性治疗策略至关重要。
在生物技术应用方面，对具有次级代谢产物合成潜力但毒力减弱的菌株进行全面表征至关重要。已研究的谱系5菌株在多种细胞系中显示减弱的细胞毒性，在感染模型中致病力低，且拥有合成具有应用价值代谢物所需的遗传机制。因此，谱系5菌株代表着未来生物技术应用的一个极具前景的资源库。通过基因工程进一步优化这些菌株的生产性能，有望推动可持续生物制造工艺的发展。
