miR-133a-3p 通过靶向 IGF1R 促进 T-2 毒素诱导的软骨细胞损伤

《Chemico-Biological Interactions》：miR-133a-3p promotes T-2 toxin-induced chondrocyte damage via targeting IGF1R

本研究利用miRNA技术探究T-2毒素诱导软骨损伤机制，发现miR-133a-3p在受损软骨中高表达，通过靶向IGF1R促进ECM降解及软骨细胞凋亡，其抑制剂则逆转此效应，共转染实验证实该调控路径。

　　

罗康婷|王玲玉|张正彦|胡一凯|赵成宇|于水园|李倩|董在超|沙彤彤|王淼|左娟|窦彦杰|张焕霞|周国玉|岳芭|于芳芳

郑州大学公共卫生学院环境卫生系，中国河南省郑州市科学大道100号，450001

摘要

T-2毒素是Kashin-Beck病的重要环境风险因素之一，该疾病会严重损害软骨。本研究利用miRNA来探究T-2毒素的毒性机制。研究发现，在T-2毒素引起的软骨组织损伤和软骨细胞损伤中，miR-133a-3p的表达显著升高。miR-133a-3p的过表达促进了T-2毒素诱导的细胞外基质降解和软骨细胞凋亡；而抑制miR-133a-3p则产生了相反的效果。这些结果表明miR-133a-3p参与了T-2毒素诱导的软骨细胞损伤过程。生物信息学分析和双荧光素酶实验表明，IGF1R是miR-133a-3p的靶标。IGF1R的小干扰RNA（Si-IGF1R）进一步加剧了T-2毒素对软骨细胞的损伤。将miR-133a-3p模拟物/抑制剂与Si-IGF1R共同转染到软骨细胞中，结果显示miR-133a-3p模拟物增强了Si-IGF1R的效应，这与miR-133a-3p抑制剂的效应相反。因此，miR-133a-3p通过靶向IGF1R来促进T-2毒素诱导的软骨细胞损伤。

引言

Kashin-Beck病（KBD）是一种地方性的慢性骨关节炎疾病，主要发生在儿童和青少年中，成年患者的残疾率较高[1]。KBD的主要病变表现为骺板软骨和关节软骨深层的细胞退化和坏死[2,3]。目前，KBD的发病机制尚不明确。多数研究认为硒缺乏和谷物中的T-2毒素污染是该疾病的主要环境风险因素[4,5]。T-2毒素广泛存在于谷物和动物饲料中，由于其低分子量和强亲脂性，可通过口腔、呼吸道和皮肤接触引发全身毒性[6,7]。过量摄入T-2毒素会导致骨骼和软骨发育障碍[8]。KBD地区的谷物中T-2毒素含量显著高于其他地区，且KBD患者的T-2毒素检出率更高，这会导致软骨深层细胞坏死[9,10]。体内实验表明，T-2毒素会导致大鼠的细胞外基质（ECM）代谢失衡，进而引发关节软骨降解和骺板异常[11]。然而，T-2毒素引起关节软骨病变的具体机制仍需进一步深入研究。

微小RNA（miRNA）是一种长度在18到23个核苷酸之间的短链非编码RNA分子[12]。miRNA通过与靶基因mRNA的3′非翻译区（UTR）特异性结合，抑制mRNA翻译或直接促进mRNA降解[13]。miRNA参与多种生理和病理调控过程，在细胞分化、凋亡和ECM降解中起着关键作用[14,15,16]。我们之前的转录组测序发现miR-133a-3p在大鼠关节软骨凋亡中起重要作用[17]。研究显示miR-133a-3p与骨骼系统密切相关；转录组测序结果显示，miR-133a-3p在骨关节炎患者中的表达显著上调[18]。另一项研究中，将miR-133a-3p模拟物转染到软骨细胞后进行转录组测序，发现miR-133a-3p参与骨骼发育过程[19]。此外，miR-133a-3p通过直接作用于胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）来抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制前列腺癌的骨转移[20]。这些结果表明miR-133a-3p参与骨骼发育过程，但其在软骨中的具体作用机制尚未明确。

在本研究中，我们建立了体内和体外模型来研究T-2毒素引起的软骨病变和软骨细胞损伤。随后构建了miR-133a-3p模拟物和抑制剂，以明确miR-133a-3p对T-2毒素诱导的软骨细胞损伤的调控作用。进一步预测并验证了IGF1R为miR-133a-3的直接靶基因，并构建了IGF1R的小干扰RNA（Si-IGF1R）模型，以研究IGF1R对T-2毒素诱导的软骨细胞损伤的影响。最终发现，miR-133a-3k模拟物/抑制剂与Si-IGF1R的共同转染增强了miR-133a-3的效应，这与miR-133a-3抑制剂的效应相反。因此，本研究旨在探索miRNA调控T-2毒素诱导的软骨细胞损伤的机制，为阐明KBD的发病机制提供新的理论依据。

动物与处理方法

从河南省实验动物中心获取了36只4周大的SPF Sprague–Dawley雄性大鼠，将其置于标准环境条件下饲养（温度22 ± 2°C，湿度40–60%，12小时光照/黑暗周期），并提供自由食物和饮水。适应一周后，将大鼠随机分为对照组、低剂量组（100 ng/g体重/天）和高剂量组（200 ng/g体重/天）。经过4周的口服暴露后，对大鼠进行麻醉并采集膝关节软骨进行分析。

暴露于T-2毒素的软骨病变中miR-133a-3p的表达增加

如图1A所示，对照组的软骨细胞数量较多、结构有序，基质染色明显；而随着T-2毒素浓度的增加，细胞数量减少，结构紊乱，基质染色变弱。Western blot结果显示，T-2毒素组中MMP13蛋白的表达水平显著升高，而COL2A1蛋白的表达水平随T-2毒素浓度的增加而降低（图1B–D）。此外，Bcl-2蛋白的表达也发生了变化

讨论

T-2毒素已被确认为Kashin-Beck病的主要环境风险因素[24]。人体摄入T-2毒素后，该毒素在消化道被吸收并导致软骨病变[25,26,27]。我们之前的转录组测序发现，miR-133a-3p在大鼠软骨中T-2毒素诱导的凋亡过程中起重要作用，其表达水平上调[17]。然而，miR-133a-3p在T-2毒素诱导的软骨细胞损伤中的具体机制尚未明确

结论

综上所述，miR-133a-3p在T-2毒素诱导的软骨细胞损伤中的表达水平升高。miR-133a-3p的过表达显著促进了T-2毒素诱导的细胞外基质降解和软骨细胞凋亡。miR-133a-3p直接靶向IGF1R，并通过这一途径促进T-2毒素诱导的软骨细胞损伤。

作者贡献声明

罗康婷：撰写初稿、数据可视化、数据整理。王玲玉：数据可视化、实验研究。张正彦：数据可视化、实验研究。胡一凯：数据可视化、实验研究。赵成宇：数据可视化、实验研究。于水园：数据可视化、实验研究、数据整理。李倩：数据可视化、实验研究、数据整理。董在超：数据可视化、实验研究。沙彤彤：数据可视化、实验研究。王淼：数据可视化、实验研究。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82003400）和河南省自然科学基金（项目编号：252300423223）的支持。