《Frontiers in Immunology》：Hepatic zinc deficiency dampens the acute phase response in patients with alcohol-associated hepatitis
引言
锌是一种必需的微量元素，构成约10%的人类蛋白质组的结构成分，在300多种酶中作为催化组分，并在约750个转录因子中作为结构成分。因此，锌在生长、性成熟、新陈代谢和免疫中扮演重要角色。全球近五分之一的人口面临锌缺乏风险，这种情况在受粮食不安全和/或慢性病影响的脆弱人群中尤为突出。免疫系统发育和稳态受损是严重锌缺乏最明显的症状之一。因此，锌缺乏与反复感染相关，源于免疫细胞成熟和功能的主要缺陷。
锌缺乏在慢性肝病(CLD)患者中尤其常见，这是由于锌吸收不良以及肝脏白蛋白(血液中锌的主要载体)产生减少导致锌滞留受损所致。因此，在肝硬化患者中，血清锌的正常化已被证明可显著改善肝功能标志物(例如胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白)，同时提高生存率并降低肝细胞癌(HCC)的发生率。酗酒可通过促进尿锌排泄增加和减少肠道吸收而加剧锌缺乏，这与肝病无关。酒精性肝炎(AH)是一种由过量饮酒引起的严重病症，其特征是黄疸快速发作，以及包括胆红素和天冬氨酸氨基转移酶(AST)在内的肝脏应激标志物升高。由于在数月到数年内过量饮酒，加上这些患者常见的肝功能不全，AH成为血液和肝脏中锌缺乏最严重的肝病之一。
由于采样的便捷性和临床诊断的需要，锌几乎完全从血清中量化，而血清锌仅占全身总锌的0.1%。血清锌也不能很好地反映组织锌浓度，而组织锌浓度可能受到锌缺乏的不成比例的影响。为了了解锌缺乏在肝病病理学中的作用，准确评估病变组织内的锌浓度至关重要。为了解决这个问题，我们假设组织内的锌状态可以根据锌刺激基因(ZSG)的表达来估计。利用公开可用的数据集，我们生成并验证了一个基因特征评分，用于估计慢性肝病(特别是AH)患者肝组织内的锌含量。该转录组锌特征评分被用于查询大型AH肝组织转录组数据集，以更好地了解肝脏锌缺乏如何促进AH的发病机制。生物信息学分析表明，锌是肝脏急性期反应的主要驱动因素。由于巨噬细胞和肝细胞是急性期反应的主要驱动者，我们使用原代肝细胞和巨噬细胞培养物在体外验证了锌的作用。这些数据表明，AH中的锌缺乏会特异性抑制巨噬细胞对感染的急性期反应，并可能通过使患者易受危及生命的感染而显著恶化长期结果。
材料与方法
基因表达数据集收集与分析
查询了美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合数据库(GEO)和PubMed，使用术语锌、TPEN (N,N,N'N'-四(2-吡啶甲基)-乙二胺)、处理、耗竭、补充和缺乏。共确定了10个锌处理和3个锌耗竭数据集，根据数据集质量和可用性，分别分析了其中9个和2个。使用R统计环境分析数据集，如补充图S1所述。简而言之，根据需要对芯片表达数据进行对数转换和分位数归一化，然后基于对数表达数据进行数据集特异性过滤。来自RNA测序平台的基因计数数据经过数据集特异性过滤，然后使用EdgeR进行归一化和离散度估计。使用经验贝叶斯差异表达统计(eBayes)分析芯片数据，使用广义线性模型拟然F检验(glmQLF)分析测序数据，并使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正以控制错误发现率(FDR)，正如我们之前所做的那样。另外还使用了Palmer等人和Tuomela等人进行的差异基因表达分析。在所有包含多于一种细胞类型的数据集(GSE39316, GSE39330)中，分别检查了细胞类型，除了数据集GSE25167，其中将HaCat和Sk Mel-28细胞转录组(各n=1)合并，以便在模拟和锌处理样本之间进行统计学比较。ZSGs定义为锌处理后基因转录显著(p<0.05)诱导≥1.5倍，或者相反，锌耗竭后降低≤1.5倍。
如上所述分析了AH转录组数据集GSE28619、GSE143318、GSE155907、GSE142530和GSE94417。使用ComBat在分位数归一化数据上合并并校正了数据集GSE94397、GSE94399和GSE103580的批次效应。美国国立卫生研究院(项目#31612)批准了访问DbGaP研究phs003112.v1.p1的权限。对于DbGaP研究，使用SRAtools(v3.0.0)下载了fastq文件和样本元数据，使用FastQC(Babraham Bioinformatics)确定文库测序质量。使用Trim Galore! (Babraham Bioinformatics)进行了Illumina适配子序列和低质量读段修整(如果读段对<20个碱基对则移除)。使用STAR 52将读段与人类基因组hg38比对，以ENSEMBL基因注释为指导。使用HTSeq生成对应于ENSEMBL基因注释的读段计数数据。生物信息学处理和分析流程已添加到
https://github.com/Scotch25/ZincALDManuscript 。
锌特征基因的选择
从11个数据集中整理了锌刺激基因表达，其中ZSGs定义为上调≥1.5倍，p<0.05。在≥5/11个数据集中被锌上调的基因被纳入初步的锌特征谱。选择5个数据集作为临界值(而不是代表所检查数据集>50%的6个)，以解释一些数据集中缺乏ZSG表达数据的情况。
样本收集
从Westmead医院和Westmead医学研究所的健康志愿者处收集血液样本。分别在Westmead医院和Blacktown医院的肝细胞癌切除术或减肥手术期间获取肝组织。所有工作均根据《赫尔辛基宣言》和《伊斯坦布尔宣言》进行。获得了悉尼西部地区卫生服务和悉尼大学的伦理批准。所有受试者均获得了知情同意。
原代和连续细胞分离与培养
使用Ficoll Paque Plus密度梯度分离法分离外周血单核细胞(PBMCs)。PBMCs在含有10%胎牛血清的RPMI培养基中于37°C、5% CO2 条件下培养。为了生成巨噬细胞，使用CD14微珠和AutoMacs Pre Separator从PBMCs中分离出5 x 105 个单核细胞。细胞在含有10%胎牛血清和50 ng/mL M-CSF的RPMI培养基中分化7天，第3天更换培养基。
从肝活检/切除术收集的人类肝组织中生成基于肝脏类器官的细胞单层。将组织切碎并用胶原酶IV(1mg/ml)在37°C下消化30分钟，然后将细胞通过100 μm细胞筛，以50 x g离心5分钟。收集代表浓缩肝细胞的细胞沉淀，将细胞重悬于扩增培养基中，并重复50 x g离心步骤两次。将肝细胞重悬于Matrigel中，并加入类器官扩增培养基。在肝脏类器官充分扩增后(传代后3-5天，类器官仍在积极扩增但相对较小时)，使用冷PBS将类器官从基质胶中取出，然后用TrypLE在37°C下消化3分钟。将单细胞悬液加入胶原包被的48孔板中，使用扩增培养基，直至细胞达到80-90%汇合。在锌补充/耗竭培养基处理前3天，将扩增培养基更换为分化培养基。类器官培养在37°C、5% CO2 条件下生长。
Huh-7细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中于37°C、5% CO2 条件下培养。所有实验处理均在约80%汇合度时进行。
体外锌处理和耗竭
如前所述进行培养基的锌耗竭。简而言之，将培养基与S100A12锌结合树脂在室温下以80 μl树脂:1 mL培养基的比例振荡孵育过夜。以400 x g离心5分钟沉淀树脂，并立即取出培养基供使用。去除培养基并用PBS洗涤一次后，将锌耗竭(ZnDep)培养基加入细胞。对于所有锌处理和补充实验，向培养基中加入50 μM ZnSO4 。
定量PCR
使用Favorgen总RNA试剂盒提取RNA，并使用MMLV逆转录酶合成cDNA。使用VIC和FAM偶联的Taqman探针或基因特异性引物和TaqMan Fast Advanced MasterMix测量基因表达。通过ΔCt方法将基因归一化为18s核糖体RNA或看家基因36B4或UBC。
流式细胞术
收集前，用PBS中的5 μM锌荧光探针Zinpyr-1在37°C下处理细胞30分钟。接下来用胶原酶处理类器官和Huh-7细胞以生成流式分析所需的单细胞悬液。用活性染料FVS700染色细胞，并使用BD Bioscience LSR Fortessa细胞分析仪或Miltenyi Biotec MACSQuant Analyser 10进行检查。为了检查单个PBMC群体，用FcR封闭试剂处理PBMCs，然后用以下组合标记：BUV395 CD3、PE-Cy7 CD56、BV711 CD14、APC-Cy7 CD19和PE-CF594 CD11c。使用FlowJo v10.8.1分析流式细胞术数据。
统计分析、生物信息学与可视化
在GraphPad Prism Version 8中分析数据并生成图形。使用的统计检验基于数据的正态性(参数与非参数)，并在图例中与生物学重复次数一起注明。所有体外实验均使用至少2个实验重复和2个技术重复进行，样本量已包含在图例中。使用ConsensusPath-DB和基因集富集分析(GSEA)软件进行功能注释。使用过度表达分析来定义与上调(>1.5倍)基因集相关的生物学过程和通路。使用Broad Institute的Morpheus软件生成基因表达热图。
结果
通过转录组分析鉴定锌刺激基因
为了鉴定被锌一致且强效诱导的基因，我们搜索了公开可用的、进行了锌处理的转录组数据集。在确定的十项研究中，有十一个锌处理数据集适合进行统计分析。分析的转录组在使用的芯片/测序技术、细胞类型、锌处理(锌盐和锌纳米颗粒)、锌浓度(25-250 μM)和处理持续时间(4-24 h)方面存在异质性。因此，显著上调(诱导≥1.5倍，p<0.05)的ZSGs数量从<10到>1000不等。
首先选择在≥5/11个数据集中被鉴定的显著上调的ZSGs，以生成初步的转录组锌特征谱。总共鉴定出18个转录本，其中以属于金属硫蛋白(MT)基因家族的基因为主。此外，一组负责DNA损伤和应激反应的基因(例如HSPA6, DDIT3)被上调，表明一些锌处理实验引发了显著的细胞应激。事实上，当检查所有数据集中ZSG的诱导情况时，只有那些使用高于150 μM的高锌浓度(例如Palmer等人，GSE60159)或锌离子载体(GSE6960)的实验刺激了转录组应激反应。使用ConsensusPath-DB进行的通路富集分析证实了数据集特异性的转录反应。高锌浓度数据集富集了细胞应激通路，而GSE99435转录组富集了金属离子反应通路，应激通路富集最少。由于体内血清锌很少超过20 μM，因此不太可能刺激此处鉴定的细胞应激反应。因此，所有与细胞应激相关的转录本均从初步的锌特征谱中移除。即使在缺乏引发锌介导的细胞应激的数据集的情况下，剩余的九个ZSGs仍然被高度上调。
接下来，我们使用在线工具PScan检查了ZSG启动子，以识别可能表明锌上调的过度表达的转录因子结合基序。我们输入了4个ZSGs列表，包括九基因锌特征谱，以及代表存在于≥5个数据集(n=18)、≥4个数据集(n=57)和≥3个数据集(n=119)中的ZSGs列表。金属转录因子1(MTF-1)的结合基序在所有基因列表中均显著富集，在九基因特征谱的每一个启动子序列中都存在结合位点。MTF-1直接被锌激活，并且是MT表达的主要驱动因素，正如敲低研究所证明的那样。
为了验证锌耗竭后的九基因转录锌特征谱，我们检查了两个使用不同锌去除方法的数据集中的ZSG表达：基于S100A12树脂的锌耗竭(GSE108923)或TPEN介导的离子螯合(GSE99204)。证实了我们的假设，在HEK293T细胞中，所有测量的锌特征基因在响应S100A12树脂基的锌螯合时均下调，并在添加锌后受到刺激。在TPEN处理的人角质形成细胞中，除了MT1F和SLC30A1被上调外，锌特征基因转录本显著减少。在两个数据集中，细胞应激标志物表达(例如，DDIT3, DNAJB1)因锌去除而增加，表明它们确实不是真正的ZSGs。
进行了转录组的功能注释，以更好地了解锌剥夺在这些数据集中的影响。S100A12介导的锌去除具有高度特异性，并且基于转录反应，对细胞过程的破坏最小。另一方面，TPEN离子螯合(对锌不具特异性)抑制了许多稳态通路，包括转录、翻译、新陈代谢和细胞周期。
在肝脏和免疫细胞模型中确认锌刺激基因的调节
为了解决ZSGs调节不一致(GSE99204)和缺乏MT表达数据(GSE108923)的问题，我们在体外进行了锌处理和耗竭实验。为了模拟主要的肝脏细胞群体，使用了三种体外模型：Huh-7肝癌细胞和原代肝脏类器官单层用于模拟肝细胞，外周血单核细胞(PBMCs)用于模拟常驻和浸润的免疫细胞。所有细胞均在模拟处理或S100A12树脂锌耗竭(ZnD)培养基中培养24小时±补充50 μM ZnSO4 。使用锌荧光探针Zinpyr-1量化细胞内锌，并通过qPCR量化ZSGs。与未经处理的Huh-7细胞相比，锌耗竭和锌处理分别导致细胞内锌含量显著降低和增加，如Zinpyr-1荧光所测量。与细胞内锌含量一致，除SLC30A1外，所有ZSGs在锌耗竭后均显著下调，并在锌处理后显著诱导。对锌浓度反应最强的基因(例如，MT1E, MT1G)通常在未经处理的Huh-7细胞中表达最高。肝脏类器官细胞内锌受到锌耗竭和处理的调节，但程度远低于Huh-7细胞。类似地，肝脏类器官ZSG表达受锌耗竭影响较小，但对锌处理高度敏感。类器官ZSG表达也独特，其中SLC30A1显示出最高的相对表达，而MT1G低于检测限。
在锌耗竭和补充后，还通过流式细胞术检查了PBMC群体以评估细胞内锌含量。未经处理的树突状细胞(DCs)和单核细胞与淋巴细胞群体相比，拥有更大的细胞内锌池，如更高的Zinpyr-1荧光所示。有趣的是，只有淋巴样细胞受锌耗竭显著影响，显示Zinpyr-1荧光降低(B细胞和NK细胞，p<0.05)。除T细胞外，所有细胞群体在响应锌处理时均表现出Zinpyr-1荧光增加，单核细胞与其他细胞相比表现出强烈的锌内流。PBMC的MT1A、MT1E、MT1G和MT1M被锌刺激，而除MT1M和SLC30A1外，所有基因在锌耗竭培养基中均显著降低。基线ZSG表达显示MT1M表达非常低，这或许反映了锌处理后的强烈诱导。
为了评估ZSGs的锌特异性诱导，除了锌(Zn2+ )之外，还用含有二价阳离子钙(Ca2+ )、铜(Cu2+ )锰(Mn2+ )、镁(Mg2+ )和铁(Fe2+ )的50 μM金属盐处理了PBMCs。除了锌，铜处理也显示出多个ZSGs的显著诱导。
肝脏锌特征在酒精相关肝病中减弱
为了比较不同慢性肝病之间的肝脏锌状态，查询了包含健康和病变肝组织数据的转录组数据集。为了简化分析，使用九个验证过的ZSGs的平均归一化对数每百万计数(CPM，RNA测序平台)或对数强度(芯片平台)生成了锌特征评分。所有9个ZSGs在锌特征评分中被赋予相同的权重，以便于跨数据集和组织使用锌特征谱，因为在不同的数据集和组织中，单个ZSGs的表达差异显著，如图所示。从慢性乙型肝炎病毒(CHB, n=3)和慢性丙型肝炎病毒(CHC, n=1)感染、脂肪变性(n=5)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH, n=5)、肝细胞癌(HCC, n=4)、肝硬化(n=5)和酒精相关肝病(ALD, n=4)的肝组织中获取ZSG表达数据，并与每个数据集中可用的健康对照进行比较，以生成每个基因的对数2倍变化(FC)。虽然慢性病毒感染和脂肪变性不影响ZSG表达，但ZSGs在响应慢性炎症(例如，NASH)和纤维化时降低，在HCC肿瘤组织中达到最低。在非癌组织中，与健康组织相比，ALD和肝硬化肝脏的ZSG表达降低最显著，支持了肝脏中的锌缺乏状态。
为了进一步研究图中概述的四个AH数据集，检查了来自健康和严重AH肝组织转录组的ZSG表达：GSE28619、GSE143318、GSE155907和GSE142530。在这四个数据集中，除MT1F在所有数据集中均达到显著性外，所有ZSGs均一致下调。
我们接下来查询了另一个肝组织数据集(登录号phs003112.v1.p1)，该数据集包含来自基因型和表型数据库(dbGaP)的人口统计学和血液检查结果，以确定由转录组锌特征评分定义的肝脏锌状态是否与任何临床参数相关。在该数据集包含的79个肝脏转录组中，10个被分类为正常，41个AH，19个慢性HCV感染和10个MAFLD。与图中概述的数据集一致，MAFLD的锌特征评分与健康肝脏相似，而急性和慢性AH均表现出显著降低的锌特征评分。
接下来，将个体锌特征评分与人口统计学信息(年龄)、血液检查结果(例如，白细胞计数)、肝功能测试(例如，AST)和预测评分(例如，终末期肝病模型[MELD])相关联。使用整个数据集，锌特征评分显示与血小板计数、白蛋白(ALB)和钠呈强正相关，同样与AST、ALP、TBIL和INR呈强负相关。在AH患者亚组(n=41)中，只有与AST的负相关仍然显著。描绘锌特征评分与白蛋白、AST和INR之间相关性的散点图突出了ALD患者与队列其余部分之间的差异。在ALD患者中，较低的肝脏锌特征评分与低血清白蛋白和低血小板计数(血小板减少症)以及延长的凝血时间(INR)相关，提示肝功能不良，同时与AST升高(肝脏炎症和肝细胞死亡的标志物)相关。
评估肝脏锌在酒精相关肝病中的作用
为了确定肝脏锌在AH发病机制中的作用，查询了三个严重AH的肝活检转录组数据集：GSE94397 (n=71)、GSE94399 (n=38)和GSE103580 (n=110)。此外，从所有三个数据集中生成了一个合并的、经过批次校正的数据集，包含219个样本。为每个患者样本生成了肝脏锌特征评分，并随后与所有四个数据集中的其他每个基因进行了相关性分析。图5A展示了所有四个数据集中前50个正相关基因。发现锌特征评分与感染急性期反应的多个成员基因呈正相关，包括补体(C5, C9)、血清淀粉样蛋白(SAA1, SAA2)和C反应蛋白(CRP)。对所得相关系数排序列表进行的基因集富集分析表明，锌特征评分与锌稳态和反应以及急性炎症反应(包括补体激活和急性期反应)相关。有趣的是，还鉴定出了生物能量和代谢反应的富集，包括ATP合成和氧化磷酸化，以及氨基酸/脂肪酸分解代谢。接下来，将每个数据集中的样本根据其锌特征评分分为四分位数并进行比较。代表具有最高锌特征评分的患者的上四分位数与具有最低锌特征评分的下四分位数进行了比较。急性期反应基因α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)、血清淀粉样蛋白A1(SAA1)、C反应蛋白(CRP)和补体成分9(C9)在具有较高锌特征评分的患者中持续较高。类似地，蛋白质分解代谢基因如谷氨酸脱氢酶(GLUD1)和精氨酸酶1(ARG1)(负责分解生糖氨基酸谷氨酸和精氨酸)在所有数据集中持续较高，但未观察到显著差异。
检查锌缺乏对急性期反应的影响
急性期反应期间锌会迅速流入肝脏，因此我们试图确定肝脏锌是否是产生急性期反应物所真正必需的。急性期反应是感染后肝脏对炎症介质(如IL-6、IL-1β和TNF)刺激肝细胞的反应。由于巨噬细胞是肝脏炎症反应的主要介质，我们首先研究了巨噬细胞IL-6和IL-1β的产生对锌耗竭的反应。将单核细胞来源的巨噬细胞在模拟、ZnD或ZnD + 50 μM ZnSO4 培养基中培养过夜，然后用脂多糖(LPS)的免疫反应成分Kdo2-脂质A(KLA)刺激6小时。巨噬细胞细胞内锌和MT1F表达在锌耗竭培养基中显著降低，支持了细胞内锌的减少。KLA诱导的IL6和IL1B表达在锌耗竭后显著降低，并在添加ZnSO4 后恢复。分泌的IL-6在响应锌耗竭时减少，而IL-1β不受影响。
接下来使用IL-1β和IL-6(各20 ng/ml)刺激Huh-7细胞和肝脏类器官单层中的急性期反应。Huh-7细胞的SAA1和ORM1表达在6小时IL-1β和IL-6处理后均增加，但只有ORM1受细胞锌状态影响，显示锌耗竭样本中表达降低，即使在添加锌后也是如此。在细胞因子刺激后测量了Huh-7培养基中SAA1蛋白的分泌，但未检测到。与Huh-7结果一致，在类器官模型中，SAA1转录本表达和蛋白分泌不受锌浓度影响。在类器官培养物中未检测到ORM1，但急性期反应物C4BPA同样不受锌影响。总之，这些数据表明，AH中的锌缺乏可能通过限制肝脏中炎症介质的表达来抑制急性期反应的启动。
讨论
虽然锌缺乏的广泛临床症状在人类中已有充分描述，但由于临床研究的局限性：复杂的临床病例、众多的独立变量、患者合并症以及组织获取有限等，其对各器官和系统的独特影响一直难以确定。为了帮助克服这些限制，我们开发并验证了一个九基因锌特征谱，用于估计组织内的锌含量，这得到了人类和小鼠锌补充和锌限制研究的支持。因此，这项工作的发现可以分为两个主题，将在本文中讨论：1) 使用当代方法生成和验证转录组锌特征谱以量化组织锌；2) 结合原代细胞培养模型和新的锌耗竭方法来证明锌缺乏如何影响肝脏对感染的急性期反应。我们使用了锌缺乏的ALD肝脏转录组来研究组织中的锌缺乏，但所提出的锌特征谱很可能用于探究不同组织和疾病状态中的锌状态。
研究细胞内锌对信号通路作用的既定方法主要依赖于锌螯合剂(如TPEN)和癌细胞系，其结果与我们的发现不一致。虽然TPEN用于螯合锌，但它已在细胞培养研究中用于螯合铜、钙和铁，此外还螯合锌。TPEN具有细胞渗透性，因此可以置换占据细胞内酶、核酸结合等作用的金属，这不能很好地代表体内发生的锌缺乏状态。我们的锌耗竭方法使用了与 S 1 0 0 A
