外周血单细胞图谱揭示肢端型黑色素瘤患者抗PD-1治疗相关不良事件的免疫特征：以CD8+ T细胞分化失衡为核心的机制与标志物探索

《Frontiers in Immunology》：Single-cell profiling of PBMCS reveals an immune signature of irAEs in anti-PD-1-treated acral melanoma patients

这篇综述性研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）深入解析了肢端型黑色素瘤（acral melanoma）患者在接受抗PD-1（anti-PD-1）免疫治疗后，发生免疫相关不良事件（irAEs）的外周血免疫细胞特征。文章首次系统地描绘了伴随irAEs出现的CD8+ T细胞分化失衡，即毒性（cytotoxic）T细胞（高表达GZMB, NKG7）扩增，而过渡性（transitional）T细胞（高表达GZMK）收缩的现象，并提出了过渡性/毒性CD8+ T细胞比率作为潜在的生物标志物（biomarker），为理解irAEs的发病机制和临床风险预测提供了新视角。

　　

引言

以抗PD-1为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）已彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗格局，但其所引发的免疫相关不良事件（irAEs）已成为影响患者治疗与生活质量的重要临床挑战。irAEs的病理生理机制尚不完全清楚，尤其在肢端型黑色素瘤这一亚型中。针对irAEs的预测性生物标志物仍很缺乏。外周血单核细胞（PBMCs）作为系统性免疫反应的微创监测窗口，是探索与疗效和毒性相关循环标志物的宝贵资源。本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，全面刻画接受抗PD-1单药（主要为特瑞普利单抗，toripalimab）治疗的肢端型黑色素瘤患者中，与irAEs发生相关的免疫特征。

结果

患者特征与irAEs

本研究纳入了八名黑色素瘤患者：三名在ICI治疗后发生irAEs（AE组），三名治疗后未发生irAEs（NAE组），以及两名未接受治疗的对照患者（UNT组）。观察到的具体irAEs包括恶心、呕吐、疲劳（使用帕博利珠单抗pembrolizumab后）、皮疹和白癜风（使用特瑞普利单抗后）以及红斑性丘疹（使用特瑞普利单抗后）。NAE组患者均接受特瑞普利单抗治疗。

抗PD-1治疗引起PBMC组成的系统性改变

对总计54，793个高质量PBMCs进行单细胞分析。与NAE组和UNT组相比，AE组CD4⁺T细胞频率降低，而CD8⁺T细胞频率增加。NAE组则表现出更高的NK细胞频率和更低的单核细胞频率。将数据标准化至总T细胞后，AE组的CD8⁺T细胞频率最高，CD4⁺T细胞频率最低。与治疗前相比，治疗后（AE和NAE组）T细胞中PDCD1（PD-1）表达降低，而CTLA4， TIGIT， LAG3， HAVCR2（TIM-3）及转录因子TOX表达增加，且这些效应在AE组中更为明显。总之，抗PD-1治疗与PBMC内T细胞亚群平衡的改变相关，表现为CD8⁺T细胞增加和CD4⁺T细胞减少，这一转变在AE组最为显著。

细胞毒性T细胞和增殖性T细胞的扩增是irAE患者的特征

对T细胞进行亚分析，鉴定出11个不同的亚群：三个CD4⁺T细胞亚群、三个CD8⁺T细胞亚群、调节性T细胞（Tregs）、γδ T细胞（gdT）、黏膜相关恒定T细胞（MAIT）、增殖性T细胞及其他未指定T细胞。通过经典标志物，将CD8 T_2定义为过渡性/效应记忆样CD8⁺T细胞（表达GZMK），CD8 T_3定义为终末效应/细胞毒性CD8⁺T细胞（表达CX3CR1， GZMB等）。分析显示，AE组处于G2/M期的细胞比例略高，增殖性T细胞的频率也较NAE组增加。与治疗前和NAE组相比，抗PD-1治疗后AE组中CD8 T_3（细胞毒性）细胞的频率增加，而CD8 T_2细胞的频率降低。CD8 T_2与CD8 T_3细胞的比率在AE组中相比UNT组大幅下降。这些结果表明，T细胞向细胞毒性和增殖性表型增强的倾向与AE组患者发生irAEs存在机制上的联系。

细胞毒性和GZMK⁺过渡性基因程序定义了不同的CD8⁺T细胞状态

差异表达基因和基因集变异分析（GSVA）表明，CD8 T_3（细胞毒性）簇富含GNLY， FGFBP2， GZMB， NKG7等细胞毒性标志物，其细胞毒性评分也最高。CD8 T_2（过渡性）簇以GZMK， CCL4， CCL5为标志，其GZMK⁺过渡性基因特征评分最高，而细胞毒性评分较低。抗PD-1治疗增强了细胞毒性和耗竭相关通路的表达，同时降低了与GZMK⁺过渡性基因、幼稚细胞标志物和高PD-1表达相关的通路表达。患者年龄与GZMK表达或GSVA评分无显著关联。基因本体（GO）分析进一步揭示，CD8 T_2簇在T细胞活化和分化相关通路中富集，而CD8 T_3簇主要在细胞毒性相关通路中富集。

过渡性与细胞毒性CD8⁺T细胞比率降低是irAEs的标志

对CD8⁺T细胞的进一步分析将其分为幼稚、过渡性（GZMK⁺）、细胞毒性1、细胞毒性2和增殖性五个簇。小提琴图显示，过渡性（GZMK⁺）簇代表了一个中间状态，表现出中等的幼稚和细胞毒性特征评分，而其GZMK过渡性特征评分达到峰值。抗PD-1治疗后，AE组的细胞毒性CD8⁺T细胞显著增加，而幼稚和过渡性（GZMK⁺）细胞相应减少。此外，过渡性与细胞毒性T细胞的比率在AE组相比UNT组显著降低。相反，NAE组的幼稚CD8⁺T细胞比例略高，细胞毒性细胞比例与UNT组相当。AE组还表现出相比NAE和UNT组更高的增殖能力。GO分析显示，AE组在细胞杀伤相关通路中特异性富集，而UNT和NAE组则更多与代谢和细胞活化通路相关。总之，这些结果进一步表明，抗PD-1治疗后，AE组细胞毒性CD8⁺T细胞显著增加，并伴有过渡性与细胞毒性CD8⁺T细胞比率降低。

轨迹分析描绘了从幼稚到细胞毒性CD8⁺T细胞的分化路径

轨迹分析揭示了CD8⁺T细胞从幼稚状态出发的两条主要分化路径：一条导向过渡性CD8⁺T细胞，另一条导向终末细胞毒性CD8⁺T细胞。过渡性CD8⁺T细胞主要位于该轨迹的中点，表明其是在完全分化为细胞毒性表型之前的关键过渡阶段。随着伪时间（pseudotime）的推移，幼稚和细胞毒性标志物在轨迹两端分别达到峰值，而GZMK， CMC1和DUSP2等标志物则在过渡阶段达到峰值，提示细胞功能的逐步转变。分支表达分析建模（BEAM）显示，向细胞毒性CD8⁺T细胞分化的轨迹特征在于NKG7， GZMB， GNLY， PRF1等细胞介导的细胞毒性相关基因的富集；而向过渡性CD8⁺T细胞分化的轨迹则与MALAT1， NEAT1， GZMK等基因的富集相关，暗示其为功能转换准备的细胞状态。这些发现表明，过渡性CD8⁺T细胞可能作为一种多功能的中介，在抗PD-1治疗后调节免疫反应，影响受控免疫反应与攻击性细胞毒性攻击之间的平衡。

讨论

本研究通过对接受抗PD-1治疗的肢端型黑色素瘤患者的PBMCs进行scRNA-seq分析，揭示了与irAEs相关的独特免疫特征。与文献一致，研究发现AE组患者总CD4⁺T细胞减少，总CD8⁺T细胞和单核细胞增加。深入分析显示，AE组患者表现出细胞毒性CD8⁺T细胞增加、GZMK⁺过渡性CD8⁺T细胞减少以及增殖性细胞升高。本研究并未发现先前报道的irAEs患者中MAIT和Tregs减少的现象。高表达GZMB， PRF1， GNLY的细胞毒性CD8⁺T细胞具有强大的效应功能，这可能有利于强效抗肿瘤活性，但也可能暗示其导致脱靶组织损伤从而引发irAEs的倾向。标记有GZMK表达的过渡性CD8⁺T细胞，似乎代表了从幼稚状态到完全细胞毒性状态之间的中间阶段。这些细胞富集GZMK⁺过渡性标志物，其细胞毒性GSVA评分较低，表明其细胞毒性能力更为克制。这种克制可能有助于缓和激进的免疫反应，从而在有效肿瘤控制和减轻治疗相关毒性之间取得平衡。它们在AE患者中的耗竭可能破坏这种平衡，有利于不受控制的细胞毒性活动和组织损伤。轨迹分析证实，GZMK⁺T细胞位于幼稚到细胞毒性分化连续体的过渡状态。这突显了过渡性与细胞毒性CD8⁺T细胞比率作为irAE风险的探索性候选生物标志物的潜力。此外，AE组患者增殖性T细胞比例增加，可能放大了具有更高反应性的克隆，这与irAEs发生率增加相符。本研究也存在局限性，例如样本量较小。未来工作应通过TCR克隆性测定和抗原特异性筛选来确定irAEs中的细胞毒性CD8⁺T细胞是自身反应性的还是肿瘤特异性的。同时，探索GZMK在过渡性细胞功能中作用的机制研究，可能为解耦疗效与毒性提供新的治疗靶点。

结论

总而言之，本研究强调了在最大化ICIs治疗效果的同时最小化其不良反应所需的微妙平衡。通过阐明细胞毒性、过渡性和增殖性CD8⁺T细胞在irAE发生中的作用，为理解肢端型黑色素瘤患者抗PD-1治疗期间的免疫失调提供了新的见解。描绘这些细胞转变及其功能后果，使我们更接近预测、预防和管理黑色素瘤患者irAEs的个体化策略。