《Advanced Science》：Generation of CCR4/CD7 Bispecific CAR-T Cells Resistant to Fratricide and Exhaustion
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本文报道了一种新型靶向CCR4/CD7的双特异性嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），通过采用CD7阴性（CD7N）的T细胞作为效应细胞，成功避免了因靶点共享导致的“自相残杀”（fratricide）效应，并展现出对CD7和CCR4表达谱异质性的T细胞恶性肿瘤的强效细胞毒性。研究通过引入表皮生长因子受体截短体（EGFRt）构建了可由西妥昔单抗（cetuximab）触发的安全开关，并利用过表达转录因子c-Jun增强了CAR-T的功能持久性，减少耗竭（exhaustion）。单细胞转录组测序（scRNA-seq）进一步揭示了一个独特的AQP3+ CD4+ T细胞亚群及其相关的Src/Ras/ERK与Bcl-2信号通路激活，提示通过调控SOS1和KLF2有望进一步增强疗效。该研究为治疗T细胞恶性肿瘤提供了一种具有更高安全性、有效性及可控性的新型CAR-T疗法策略。
引言
淋巴细胞（B细胞或T细胞来源）恶性肿瘤在美国是第四大常见癌症和第六大癌症死亡原因。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在治疗化疗耐药的B细胞恶性肿瘤（如靶向CD19或BCMA）方面显示出显著疗效。CAR分子通过其单链可变片段（scFv）引导工程化的T淋巴细胞靶向肿瘤细胞表达的抗原。与传统的T细胞受体介导的识别不同，CAR-T细胞介导的信号传导不受主要组织相容性复合体（MHC）呈递的限制，使其能够直接识别、杀死肿瘤细胞并增殖。CAR-T疗法在T细胞恶性肿瘤的早期研究中也取得了令人鼓舞的结果，自体CD7 CAR-T的完全缓解率超过90%。CD7因其在恶性白血病细胞上的独特表达模式而成为T细胞恶性肿瘤有前景的治疗靶点。它常见于未成熟T细胞恶性肿瘤（如缺乏CD5和CD1a表达的ETP-ALL），并且能在T-ALL患者治疗后微小残留病灶阶段被检测到。然而，随着CAR-T应用从B细胞肿瘤扩展到T细胞肿瘤，仍然存在显著障碍。针对T细胞靶点的特定障碍在于，抗原（如CD7）通常在正常T细胞和癌细胞之间共享，导致CAR依赖的自相残杀（fratricide）。B细胞和T细胞靶向共有的挑战包括不良事件，如细胞因子释放综合征（CRS）或继发性恶性肿瘤，以及由于抗原逃逸或CAR-T耗竭导致的癌症复发。在一个针对CD7 CAR-T疗法的200名受试者的系统综述中，CRS的发生率高达94%。抗原阴性复发的比例似乎也很高。在一项CD7 CAR-T的2期研究中，60名患者中有13人复发，其中5/13（38.5%）的患者CD7表达丢失。相比之下，CCR4是一种G蛋白偶联的趋化因子受体，其特征是具有七个跨膜结构域，可特异性识别趋化因子CCL17和CCL22。与CD7不同，CCR4在各种成熟T细胞肿瘤中高表达。随着皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的进展，CD7表达丢失和CCR4表达增加是常见的观察结果。因此，同时靶向CD7和CCR4可能缓解CD7导向CAR-T治疗期间的抗原逃逸，并将治疗适用性扩展到未成熟和成熟T细胞肿瘤。
为了应对CAR-T疗法治疗T细胞恶性肿瘤的主要挑战，本研究首先构建了一种靶向CD7和CCR4的新型串联CAR。其次，引入了一个简单的CD7细胞去除步骤以限制自相残杀。第三，通过过表达c-Jun改善了CAR-T的功能持久性。第四，通过包含一个截短的表皮生长因子受体（EGFRt）自杀域，使得在发生不良事件时能够消除CAR-T细胞。最后，进行了单细胞分析以进一步阐明CAR-T的生物学特性，并找出潜在的治疗增强途径。
结果
2.1 制备抗自相残杀的免疫效应细胞
为了开发CCR4/CD7双价CAR-T，尚不清楚外周血单核细胞（PBMCs）的单步CD7去除是否足以避免自相残杀，或者是否需要同时去除CCR4/CD7。在PBMCs中，大多数CD3阳性细胞是CD7阳性（94.6% ± 0.68%），而19.96% ± 3.73%的CD3阳性细胞表达CCR4。经过单步免疫磁珠CD7去除后，发现CD7阴性部分（以下称为CD7N）中的大部分细胞（中位数85%）是CCR4阴性，这表明为了后续临床开发避免细胞损失和额外成本，可能不需要进一步去除CCR4。这些CD7N细胞在与白介素-7和白介素-15一起培养时表现出强大的扩增能力，而与白介素-2培养形成对比。CD7N细胞在14天的培养期间持续高表达CD3，但不表达CD7。通过CD3和CD28激动剂TransAct激活24小时后，CD69和CD25在CD7N细胞中的表达分别从平均4.1%（± 0.1%）和36.4%（± 0.6%）上调至70.92%（± 7.8%）和52.2%（± 11.6%）。尽管这些上调水平低于CD7去除后的CD7阳性部分以及未经选择的（Bulk）T细胞，但这些观察结果表明，大多数CD7N细胞可以被CD3/CD28激动剂激活，以进行后续的CAR载体转导。
2.2 单个CAR的活性及靶向CCR4的安全性
为了验证每个单独的scFv和CAR的特异性和活性，生成了单靶向CAR-T细胞，并测试了它们对表现出不同CD7和CCR4表达谱的癌细胞系的活性。CAR表达通过重组人CD7蛋白和蛋白L结合来确定。尽管效应细胞与靶细胞（E:T）比率低于1:1，两种类型的单靶向CD7N CAR-T细胞对T细胞系CCRF-CEM、ALL-SIL和HuT78均表现出显著的细胞毒性。CD7亮但CCR4暗的Jurkat细胞对带有抗CD7 CAR的T细胞的细胞毒作用敏感，但对带有抗CCR4 CAR的T细胞敏感性低得多。总的来说，这些结果证实了每种单靶向CAR的普遍活性和特异性。
在构建双特异性CAR之前，使用Tabula Sapiens单细胞RNA测序数据集（一个涵盖健康个体24个组织和器官的全面人类参考图谱）评估了CCR4的安全性特征。结果表明，CCR4的表达主要局限于胸腺，但表达水平仍然很低。
2.3 生成和表征CCR4/CD7双特异性CAR-T细胞
为了生成串联CAR，首先使用相同的scFv比较了CCR4/CD7与CD7/CCR4两种构型。与CD7/CCR4 CAR相比，CCR4/CD7串联CAR对Jurkat、ALL-SIL和CCRF-CEM细胞表现出更强的细胞毒活性，而两种构建体对髓系对照细胞系K-562均未显示出显著的细胞毒性。随后，比较了由CD7阴性T细胞生成的CD7 CAR-T细胞、CCR4 CAR-T细胞和双特异性CCR4/CD7 CAR-T细胞对白血病细胞系Jurkat、CCRF-CEM和ALL-SIL的细胞毒性作用。结果表明，CCR4/CD7 CAR-T细胞对Jurkat细胞的杀伤活性强于单独的CD7或CCR4 CAR-T细胞。
随后比较了CD7N T细胞和Bulk T细胞作为CCR4/CD7 CAR的免疫效应细胞。通过重组人CD7蛋白检测转导效率。值得注意的是，Bulk CAR-T中的CAR表达显著低于CD7N CAR-T。Bulk CAR-T表现出扩增受损，与自相残杀一致，而CD7N CAR-T和未转导的Bulk T细胞在体外培养8天期间表现出良好的增殖。在培养期末，CD7N CAR-T和Bulk CAR-T的细胞组成不同，与Bulk CAR-T相比，CD7N CAR-T的CD4/CD8比率更高。此外，在转导后，Bulk CAR-T中富集了初始T细胞，而中枢记忆T细胞在CD7N CAR-T中占主导。虽然CD7N CAR-T细胞中更频繁地表达LAG-3，但在Bulk或CD7N CAR-T组中，大多数细胞不表达任何免疫检查点受体LAG-3、PD-1或CTLA-4。与Jurkat细胞共培养4小时和24小时后，分别评估了Bulk和CD7N CAR-T的脱粒和细胞因子释放能力。两种CAR-T群体都能够进行CD107脱粒和释放细胞因子。此外，即使E:T比率低于1:1，两种CAR-T产品对全部4种T系细胞系都表现出强大的细胞毒性，但对髓系K-562对照没有。
使用CD7阴性复发模型进一步验证了双特异性CD7N CAR-T细胞的细胞毒效力。即使在E:T比率低于1:1的情况下，CD7N CAR-T细胞对CD7敲除的CCRF-CEM细胞或表达CCR4的K-562细胞仍保持强大的杀伤活性。总的来说，这些数据表明，串联CAR对于表达CCR4和CD7水平各异的多种恶性T细胞是有效且特异的。
2.4 CCR4/CD7双特异性CD7N CAR-T在体内展示抗肿瘤效应
使用异种移植模型评估了CCR4/CD7双特异性CD7N CAR-T的抗肿瘤疗效。该模型是通过将CCRF-CEM-萤火虫荧光素酶细胞注射到NSG小鼠尾静脉建立的。与未治疗的小鼠相比，接受CD7N CAR-T细胞治疗的小鼠在肿瘤进展延迟和生存期显著延长方面表现出明显差异。在接受CD7N CAR-T细胞治疗的小鼠中，CAR-T给药后第1天血清穿孔素水平显著升高。这一结果证实了CD7N CAR-T细胞在体内靶向CD7高CCR4高肿瘤的强大抗肿瘤疗效。
为了进一步评估双特异性CD7N CAR-T在体内对另一种肿瘤细胞系的疗效，选择了Jurkat细胞系，其CD7阳性但CCR4低/阴性，模拟了治疗CCR4阴性T细胞恶性肿瘤或CCR4在靶向治疗后发生抗原逃逸的情况。通过尾静脉注射Jurkat-萤火虫荧光素酶细胞建立了第二个NSG小鼠模型。在该模型中，即使肿瘤细胞仅表达CD7而不表达CCR4，CD7N CAR-T也显示出显著的抗肿瘤活性。当在CAR-T治疗后的第1天和第8天测量小鼠血液中的细胞因子和细胞溶解分子时，观察到第1天高水平的颗粒酶A和穿孔素以及第8天高水平的干扰素-γ。此外，主要器官的病理学检查未发现微观异常，表明CD7N CAR-T未在小鼠中引起组织学毒性。这些结果进一步验证了双特异性CD7N CAR-T细胞在体内针对CD7高CCR4低肿瘤的强大抗肿瘤作用。
2.5 通过EGFRt开关增强双特异性CD7N CAR-T细胞的安全性
尽管CCR4/CD7双特异性CD7N CAR-T在小鼠模型中未显示任何组织学异常或治疗相关死亡率，但在发生严重CRS、持续性T细胞发育不全或继发性CAR阳性T细胞恶性肿瘤等不良事件时，安全开关是可取的。为了解决这些问题，通过双顺反子设计将EGFRt结构域整合到CCR4/CD7双特异性CAR构建体中。该EGFRt系统允许在施用抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗时选择性消除CAR-T细胞。首先使用重组人CD7蛋白确认了CCR4/CD7双特异性CAR构建体（包括Bulk CAR-T-EGFRt和CD7N CAR-T-EGFRt）的表达。此外，添加EGFRt并未改变CD7N CAR-T细胞的常规表型和细胞组成，包括高的CD4/CD8比率和占主导地位的中枢记忆T细胞群体。CD7N CAR-T EGFRt产生的促炎细胞因子干扰素-γ水平与Bulk CAR-T-EGFRt相比有所增加。EGFRt CAR-T细胞能够有效杀死Jurkat细胞，同时保留K-562对照细胞。即使在低至1 μg/mL的浓度下，加入西妥昔单抗24小时也会导致EGFRt CAR-T细胞显著的细胞溶解。
2.6 通过c-Jun过表达增强CAR-T功能
虽然安全性至关重要，但如果能改善无耗竭的CAR-T细胞功能，CCR4/CD7双特异性CAR的进一步临床开发可能会更成功。为了增强CD7N CAR-T细胞的功能持久性，测试了一种过表达转录因子c-Jun的CCR4/CD7 CAR构建体。使用这个新载体，在体外测试了CD7N CAR-T的CAR表达和细胞毒性。CD4/CD8比率也未改变，并且转导后中枢记忆T细胞群体仍占主导。值得注意的是，在构建体中不含c-Jun的情况下，大约20-30%的CAR-T细胞呈耗竭标志物LAG3阳性；然而，含有c-Jun时，LAG-3阳性的CAR-T细胞频率显著降至10%以下。在功能上，与未过表达c-Jun的CD7N CAR-T相比，CD7N CAR-T-C-JUN细胞在体外每两天用新鲜Jurkat细胞反复挑战时，表现出增强的持久性。这些CD7N CAR-T-C-JUN细胞在与Jurkat细胞共培养后24小时内迅速产生干扰素-γ和颗粒酶B。总的来说，这些发现表明，当过表达c-Jun时，CD7N CAR-T细胞的耗竭标志物表达减少，体外功能持久性得到改善。
2.7 CCR4/CD7双特异性CD7N CAR-T的转录组分析
除了c-Jun，我们试图探索其他可能进一步增强CD7N CAR-T功能的分子通路。在受到Jurkat细胞系刺激后，单细胞RNA测序数据的差异表达基因分析揭示了CD7N CAR-T、Bulk CAR-T和未转导CD7N细胞中的九个不同的T细胞亚群。CD8+ T细胞簇显示了初始和激活的组织驻留记忆/效应记忆亚群，后者以高水平的颗粒酶A、干扰素-γ、CCL4和CCL3表达为特征。CD4+ T细胞区室包括七个簇：IL13+ T辅助2细胞；STAT1+ T辅助1细胞；FOXP3+调节性T细胞；AQP3+ Ki-67+增殖性T细胞；LEF1+ TCF7+初始T细胞；CDC20+效应记忆T细胞；以及IL-9+ T辅助9细胞。虽然Th1/Th2/初始细胞在Bulk CAR-T中相对丰富，而Treg/AQP3+细胞在未转导CD7N细胞中富集，但CD7N CAR-T中的簇分布似乎更加平衡，所有簇都显示出中等频率分布。
与未转导CD7N细胞相比，差异表达基因分析后的基因本体富集分析表明，CD7N CAR-T的簇1和簇6中与细胞间粘附通路相关的基因表达显著更高，包括ICAM1、FYN和ANK3。BIRC3编码细胞凋亡抑制蛋白2，并调节肿瘤坏死因子α对NF-κB转录因子的激活，它在多个簇中高表达，同时伴有TNFAIP3、TRAF3、NFKB1A和TNFSF10的表达升高。总的来说，这些数据表明，当暴露于癌细胞时，CD7N细胞中的CAR结合导致了一个以T细胞粘附、激活、存活和细胞因子信号传导为特征的转录组谱，特别是涉及肿瘤坏死因子超家族。
尽管表达相同的CAR，但CD7N CAR-T细胞和Bulk CAR-T细胞的转录组存在显著差异，CD7N CAR-T在簇1、3、5和7中SOS1的表达水平显著更高；在簇2、3和7中PTPRC的表达更高；在簇2、3和5中LGALS3的表达更高。虽然SOS1是Ras/MAPK通路的关键组成部分，对T细胞增殖和细胞因子产生至关重要，但PTPRC编码的CD45和LGALS3编码的半乳糖凝集素-3可能通过Src和Bcl-2通路传递信号以抑制细胞凋亡。因此，当使用CD7N细胞而不是Bulk T细胞作为免疫效应细胞时，Src/Ras/Bcl-2通路被更广泛地以更高水平激活，特别是在AQP3+增殖性CD4+ T细胞中。
2.8 簇3 AQP3+增殖性细胞的演化轨迹和受体-配体相互作用
由于簇3 AQP3+ Ki-67+ CD4+ T细胞在转录组上与未转导CD7N细胞和Bulk CAR-T细胞相比，在CD7N CAR-T组中差异最为显著，包括特征基因如BIRC3、SOS1、PTPRC和LGALS3，我们进一步探索了它们的生物学特性。与其他八个簇相比，簇3中的细胞表现出与细胞增殖相关的基因表达升高，以及与记忆形成相关的基因表达升高。与Bulk CAR-T和未转导CD7N相比，CD7N CAR-T中的簇3细胞具有最高的激活和细胞毒性基因转录组特征。此外，与Bulk CAR-T相比，CD7N CAR-T中增殖基因的表达水平更高，而与未转导CD7N细胞相比，记忆表型在CD7N CAR-T中较少见。因此，这些数据表明，CAR信号传导可能驱动CD7N CAR-T转录组谱的增殖和去分化。除了在CD7N CAR-T细胞中富集的SOS1外，KLF2在簇3中也显示出相对较高的转录水平。与它们的CD7阳性对应物相比，CD7N CAR-T细胞中SOS1和KLF2的表达都显著升高。使用簇4作为分化通路的根进行的轨迹分析证实，来自Bulk CAR-T样本的簇3细胞主要位于伪时间轨迹的根部附近，而在CD7N CAR-T样本中，这些细胞主要位于伪时间的末端，同时富集了与有丝分裂和激活相关的基因，以及SOS1和KLF2表达的增加。由于KLF2与保持干细胞样T细胞特性和抑制终末功能障碍有关，这些发现表明，双特异性CAR信号传导可能缓解CD7N CAR-T产品中与耗竭相关的表型，这与体外实验观察到的表型一致。
为了研究簇3细胞在CD7N CAR-T和Bulk CAR-T群体中的簇间通讯，进行了配体-受体相互作用分析。与CD7N CAR-T相比，Bulk CAR-T中的簇3细胞具有更广泛的簇间通讯和配体-受体相互作用。相比之下，CD7N CAR-T中的簇3细胞主要通过PPIA-BSG与簇5和簇6相互作用，以及通过MIF-CD74/CXCR4与簇1和簇2相互作用。值得注意的是，簇3细胞通过肿瘤坏死因子超家族与除簇5之外的所有其他簇进行广泛的配体-受体相互作用。相比之下，Bulk CAR-T的簇3上的半乳糖凝集素-9独特地与多个其他簇上的CD45、CD44和P4HB相互作用，这可能有助于Bulk CAR-T亚群之间的抑制性信号传导。
讨论
为了克服CAR-T疗法治疗T细胞恶性肿瘤中常见的自相残杀、T细胞耗竭、抗原逃逸和持续性T淋巴细胞减少症等挑战，本研究首先建立了使用CD7阴性细胞靶向CCR4和CD7的双特异性CAR-T细胞。将转录因子c-Jun整合到CAR构建体中赋予了抵抗耗竭的能力，而过表达EGFRt则作为安全开关，能够在CAR-T细胞持续存在期间发生不良事件时选择性清除它们。虽然单靶点CD7 CAR和CCR4 CAR在之前的临床前研究中已有探索，但本研究首次开发了同时靶向CCR4和CD7的双特异性CAR。CD7因其在超过95%的T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤和一部分外周T细胞淋巴瘤中的高表面表达，已成为未成熟T细胞恶性肿瘤最常见的CAR靶点。然而，大多数成熟T细胞肿瘤是CD7阴性的，这曾被用于诊断目的。将CCR4纳入双价CAR构建体是为了覆盖成熟T细胞恶性肿瘤，并减轻随着时间的推移在皮肤T细胞淋巴瘤中观察到的CD7阴性进展的风险。先前的临床前研究表明，CCR4单靶向CAR对成熟的人类T细胞淋巴瘤具有活性。在本研究中，CCR4和CD7 CAR在具有可变靶点表达谱的一系列T细胞恶性肿瘤中，对于单靶向和双靶向均具有活性，包括仅低水平表达CD7和CCR4的皮肤T细胞淋巴瘤HuT78。除了T细胞肿瘤外，CD7也在一些髓系恶性肿瘤中表达，例如30%的急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征，这与不良预后相关。进一步尝试将此双特异性CAR应用于髓系恶性肿瘤值得研究。
抗自相残杀的CD7 CAR-T已经通过基因组编辑、表面下调、瞬时CAR信号抑制或使用CD7阴性效应细胞等方法开发出来。使用CCR4/CD7双特异性CAR的一个主要担忧是它是否会加剧CAR-T细胞的自相残杀，导致制造和治疗失败，因为只有一小部分血液T细胞是CCR4/CD7双阴性，并且仅CD7基因编辑/表面下调无法避免CCR4介导的CAR-T自相残杀。此外，使用CRISPR/Cas9方法敲除CD7受到意外基因改变、基因编辑嵌合性、监管障碍、制造复杂性和成本的限制。相比之下，本研究的CD7N选择过程是非基因毒性的，经过简单的仅需两小时的CD7去除程序后，可便捷地获得超过95%纯度的CD7阴性细胞。这些CD7N细胞在含有白介素-7和白介素-15的培养体系中增殖良好，在双价CAR载体转导后8天内实现了超过10倍的扩增，与未经选择的起始细胞相比，自相残杀最小。
CAR-T治疗后的不良事件很常见；有些可能危及生命，包括严重的细胞因子释放综合征、T淋巴细胞减少症或第二恶性肿瘤。虽然由于自然存在的CD7阴性T细胞的恢复，在大多数CD7 CAR-T接受者中未观察到完全的T细胞发育不全，但使用CCR4/CD7双特异性CAR可能会加剧免疫缺陷的风险。器官（如肺）中可能表达低水平的CCR4，导致靶上脱瘤的不良事件。在这方面，本研究的CCR4 CAR-T细胞对从健康小鼠获得的CCR4阳性T细胞具有细胞毒性；然而，在小鼠模型中未观察到肺毒性。对于CD19 CAR-T，先前的研究表明，某些复发可归因于表位掩蔽，即当CAR基因在T细胞制造过程中无意中被引入白血病B细胞时，导致CAR与白血病细胞表面的CD19表位发生顺式相互作用。对于T系白血病，这种不良事件不容易通过在转导前富集T细胞的策略来预防，因为白血病细胞可能表达相同的T细胞抗原。CAR-T细胞中过表达c-Jun可能会进一步增加白血病增殖的风险。考虑到这些限制，本研究测试了在发生此类不良事件时，通过将EGFRt整合到双特异性CAR载体设计中来消除CAR-T细胞的可行性。虽然未观察到CCR4/CD7 CAR-T的表型和功能发生改变，但该细胞可被市售抗体西妥昔单抗以低至1 μg/mL的浓度轻易裂解，显著低于西妥昔单抗接受者血浆中的通常谷浓度。在接受重复每周剂量的西妥昔单抗治疗后约100天，曾报道过罕见的严重肺部毒性病例。对于本研究的双特异性CAR-T细胞，发现即使在低浓度下短至24小时的西妥昔单抗暴露也可导致三分之一的CAR-T细胞发生细胞溶解。因此，消除CAR-T所需的相对较短的西妥昔单抗暴露时间可能毒性较小。
鉴于CAR-T可以通过安全开关关闭，我们试图确定持续激活原癌基因是否能减少CAR-T耗竭，这是癌症复发的另一个常见机制。在这方面，c-Jun和碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子可能通过取代激活蛋白-1和干扰素调节因子复合物中的其他抑制性家族成员来诱导抗耗竭，这些家族成员通常驱动T细胞走向耗竭和终末分化。之前已经证明，在Bulk CAR-T细胞中过表达c-Jun可以改善抗肿瘤效力并促进细胞存活；然而，其对CD7N细胞的影响尚不确定，因为CD7阴性T细胞代表了一个更终末分化的群体，与CD7阳性T细胞相比，表现出降低的激活和增殖潜力。确实，本研究在此证明了CCR4/CD7双特异性CD7N CAR-T在体外反复挑战白血病细胞后表现出功能耗竭；然而，在这些CAR-T细胞内过表达c-Jun改善了它们的功能持久性。
单细胞转录组分析显示，CD7N CAR-T细胞主要由CD4+ T细胞组成，并且在肿瘤暴露后发生转录组变化。在与细胞粘附、激活、存活和细胞因子信号传导相关的通路中观察到显著的基因表达改变。一个独特的AQP3+细胞亚群尤其值得注意，它具有广泛激活的Src/Ras/ERK/Bcl-2通路的转录组特征，以及涉及PPIA/MIF和肿瘤坏死因子超家族的簇间配体-受体相互作用。SOS1和KLF2被鉴定为在CD7N CAR-T细胞中上调最显著和差异最大的基因。SOS1调节PIK3CD，其功能获得性突变已被证明可以增强CAR-T信号传导、细胞因子产生和白血病细胞杀伤。最近，另一项研究表明，KLF2可以促进效应性CAR-T细胞的分化并防止终末耗竭，从而增强CAR-T疗效。总的来说，这些数据提出了调控SOS1和KLF2可能成为增强CAR-T细胞疗效的潜在途径的可能性。
虽然当前研究利用异种移植模型证明了CD7N双特异性CAR-T细胞在体外和体内的有效性和安全性，但必须承认几个局限性。在临床转化之前，需要在患者来源的异种移植物等模型中进行进一步验证。尽管本研究中观察到c-Jun过表达可以维持CAR-T细胞的功能持久性并减少体外反复肿瘤挑战后的耗竭，但它是否能在体内维持CAR-T细胞的持久性仍有待确定。未来的体内研究需要使用整合了c-Jun和EGFRt的CAR构建体，以最终评估长期功能持久性、晚期不良事件以及西妥昔单抗介导的安全开关的永久性。虽然配体-受体相互作用分析揭示了PPIA/MIF在暴露于癌细胞后参与CAR-T的簇间通讯，但大多数相关的配体-受体相互作用将与T细胞区室外的细胞发生，这强调了在未来分析中进行更广泛研究的重要性。尽管在CD7N CAR-T细胞中观察到了SOS1和KLF2
