《The Journal of Molecular Diagnostics》：Droplet-Digital and Reverse Transcription Quantitative PCR Comparison for Circulating miR-371a-3p in Malignant Germ Cell Tumors
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恶性生殖细胞肿瘤诊断中RT-qPCR较ddPCR灵敏度更高，AUC分别为0.94和0.82，支持RT-qPCR作为标准临床方法，ddPCR需进一步优化。
米歇尔·M·努尼奥（Michelle M. Nu?o）|马修·J·默里（Matthew J. Murray）|约翰·T·拉芬（John T. Lafin）|辛齐娅·G·斯卡皮尼（Cinzia G. Scarpini）|王昭辉（Zhaohui Wang）|杰弗里·加根（Jeffrey Gagan）|贾立伟（Liwei Jia）|谢丽尔·M·刘易斯（Cheryl M. Lewis）|莎拉·默里（Sarah Murray）|简·史密斯姆（Jane Smitham）|克里尼奥·贾尼库（Krinio Giannikou）|克里斯蒂娜·贾米森（Christina Jamieson）|维塔利·马尔古利斯（Vitaly Margulis）|所罗门·L·沃尔杜（Solomon L. Woldu）|尼古拉斯·科尔曼（Nicholas Coleman）|詹姆斯·F·阿马特鲁达（James F. Amatruda）|林赛·克洛斯特肯珀（Lindsay Klosterkemper）|A·林赛·弗雷泽（A. Lindsay Frazier）|阿迪蒂亚·巴格罗迪亚（Aditya Bagrodia）
南加州大学人口与公共卫生科学系，洛杉矶，加利福尼亚州
摘要
先前的研究表明，循环中的miR-371a-3p在检测恶性生殖细胞肿瘤（MGCT）方面具有比现有生物标志物更高的敏感性和特异性。本文比较了两种常用测量miR-371a-3p水平的方法：逆转录定量PCR（RT-qPCR）和滴液数字PCR（ddPCR）。来自德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）和剑桥大学（UoC）的样本分别按照当前协议（RT-qPCR）或制造商的标准建议（ddPCR）进行了检测。共有70名患者的数据可供分析，其中包括36名MGCT患者和34名对照组（非恶性GCT、非GCT癌症及非癌症对照组）。通过接收者操作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）来评估这两种方法的性能。RT-qPCR得到的原始miR-371a-37p Cq值通常较低（即miR-371a-37p含量较高），而ddPCR检测到的阳性滴液数量在MGCT患者中更多。使用RT-qPCR和ddPCR时的AUC分别为0.94（95%置信区间：0.90, 0.99）和0.82（0.70, 0.93）。因此，在当前的研究队列中，RT-qPCR的分类性能优于ddPCR，这支持了在标准临床实践中继续使用RT-qPCR的合理性。在ddPCR被考虑用于临床应用之前，还需要进一步的研究来优化其性能。
引言
生殖细胞肿瘤（GCT）是青少年和年轻成人中最常见的实体瘤。1尽管GCT患者的预后较好，但治疗的晚期并发症包括第二恶性肿瘤、早发性心血管疾病、致残性神经病变和听力损失，这些都会显著影响已治愈患者的生活。2目前用于恶性GCT（MGCT）的血清生物标志物包括甲胎蛋白（AFP）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）；然而，并非所有MGCT组织亚型都会分泌这些血清生物标志物，因此只有大约60%的患者在诊断时呈“标志物阳性”。3由于大量患者缺乏此类标志物，因此需要更好的诊断工具，以便患者能够获得更好的治疗建议，从而减少过度治疗或治疗不足的情况。
微小RNA（miRNA）是潜在的MGCT循环生物标志物。特别是miR-371a-3p，在诊断睾丸MGCT方面表现出比现有生物标志物更高的敏感性和特异性；4然而，在这种miRNA用于临床之前，需要全面了解其重复性、阈值设定、最佳检测性能和解释方法。迄今为止，逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是最常用的测量循环miR-371a-37p水平的方法，并且已经设计了相应的协议来检测血清、血浆和脑脊液中的miR-371a-37p。5通过对miR-371a-37p定量协议的不断改进，最近引入了一种不确定结果范围（即既不是阴性也不是阳性的结果）。6在我们的实验室中，经过严格的质量控制检查后，对于首次PCR检测中miR-371a-37p Cq值在28到35之间的样本，会要求重新检测。6根据第二次PCR的结果进行分类：如果第二次检测的Cq值小于28，则判定为阳性；大于35则判定为阴性；介于28到35之间的则判定为“不确定”。6最近的研究表明，基于这一推荐的RT-qPCR检测方法的敏感性为100%，特异性约为97%。7最近，滴液数字PCR（ddPCR）也被提出作为测量循环miR-371a-37p水平的潜在替代方法。实际上，已有几个研究小组探讨了ddPCR在MGCT诊断中的应用性能。8,9本研究比较了RT-qPCR和ddPCR在早期MGCT疾病谱中的检测性能，以更好地了解这两种方法的优缺点。
样本收集与处理
样本收集与处理
在获得机构审查委员会（IRB）批准并取得患者同意后，从德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）的患者中收集了血清样本（IRB批准号：STU-102010-051）。在英国剑桥大学（UoC）的研究中，该研究获得了多中心儿童癌症和白血病组（CCLG）组织库的批准（East-Midlands/Derby REC参考编号08/h0405/22+5，涵盖生物研究CCLG-2002-BS03和CCLG-2020-BS02）。
结果
共有70名患者的数据可供分析，其中36名（51.4%）患有MGCT，34名（48.6%）为对照组（表1）。MGCT患者的平均年龄高于对照组（MGCT：29.9岁；对照组：15.8岁）；值得注意的是，先前的研究表明，循环miR-371a-37p水平与年龄或生物学性别无关。7大约80%的样本来自男性患者（MGCT：94.4%；对照组：61.8%），且大多数MGCT患者……
讨论
先前的研究显示，循环中的miR-371a-37p作为睾丸MGCT的生物标志物具有潜在价值，因此需要使用现有的技术制定稳健的标准操作程序（SOP）作为“黄金标准”。随着技术的不断进步，进一步优化这种生物标志物的定量方法非常重要。目前通常使用RT-qPCR来测量循环中的miR-371a-37p水平，但最近引入了ddPCR技术，提供了新的可能性。
结论
循环miRNA作为疾病生物标志物显示出巨大潜力，其敏感性已经优于现有的AFP和HCG。4已有研究探索了使用ddPCR来提高循环miR-371a-37p的定量准确性。本研究直接比较了这两种方法，发现RT-qPCR在检测敏感性方面优于ddPCR。值得注意的是，其他（非基于滴液的）数字PCR方法也可以实现绝对定量。
作者贡献
M.M.N.负责统计分析；M.M.N.、M.J.M.、J.T.L.、C.G.S.和A.B.负责数据解读；M.J.M.、J.T.L.、C.G.S.和A.B.负责研究概念/设计；M.J.M.、J.T.L.、C.G.S.和A.B.负责样本/数据库管理；M.J.M.、J.T.L.、C.G.S.和A.B.负责样本处理和分析；L.J.提供病理分类和支持；S.M.和J.S.负责数据收集；M.J.M.、C.M.L.、V.M.、S.L.W.和A.B.参与了研究的其他工作。
