采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对九味强藿颗粒的化学成分及体内代谢物进行系统表征

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Systematic Characterization of Chemical Constituents and In Vivo Metabolites of Jiuwei Qianghuo Granules by UPLC-Q-TOF-MS/MS

九味羌活颗粒化学成分鉴定及代谢途径研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS系统分析，鉴定144种成分（含43种香豆素、32种黄酮类等），并检测到62种原型化合物及38种代谢产物，揭示其代谢机制及药效物质基础。

　　

Zihang Xu|Chen Zhou|Mengru Wu|Shenqi Sun|Hongfei Wu|Jingyao Xia|Mengjiao Zhou|Yehan Zhu|Beibei Xiang|Yaqi Yao

天津中医药大学中药学院，中国天津

摘要

九味强藿颗粒（JWQHG）是一种由九种草药组成的传统中药制剂，已在临床实践中广泛应用了几个世纪。然而，其化学成分和在体内的代谢途径尚未得到充分研究，这限制了我们对它的治疗机制的理解。因此，本研究旨在系统地分析其化学成分，并确定大鼠口服给药后体内吸收和代谢的成分。为了便于化合物的鉴定并研究其潜在的药效学基础，我们进一步总结了不同结构类别代表性化合物的质谱裂解模式和代谢途径。使用UPLC-Q-TOF-MS/MS对体外原型成分和体内代谢物进行了定性分析，化合物鉴定基于保留时间、准确质量和MS/MS数据，通过Masslynx 4.2软件完成。最终，在JWQHG提取物中鉴定出144种化学成分，而在给药后的大鼠血浆、尿液和粪便中检测到62种原型化合物和38种代谢物。这些化学成分主要分为香豆素、黄酮类、色酮类、三萜类和有机酸。值得注意的是，原型化合物在体内占主导地位，而代谢物主要是通过羟基化、甲基化、去甲基化、葡萄糖醛酸化等相关代谢过程形成的黄酮类和有机酸。这项研究为JWQHG提供了相对全面的化学和代谢特征描述，有望为其药效学基础的进一步阐明、质量控制标准的完善以及临床应用的合理化提供参考。

引言

九味强藿颗粒（JWQHG）源于传统的九味强藿汤配方，该配方最早记载于金代的《节古要珍》中。其成分包括Notopterygium incisum、Saposhnikovia divaricata、Atractylodes lancea、Asarum heterotropoides、Ligusticum chuanxiong、Angelica dahurica、Scutellaria baicalensis、Glycyrrhiza uralensis和Rehmannia glutinosa。临床上，它用于治疗风寒湿痹，症状包括寒战、发热、头痛和肢体疼痛。这些治疗效果主要来源于各草药成分的活性物质或其协同作用，这种现象在中医中被称为“配伍”（Peiwu）。来自Scutellaria baicalensis的活性成分baicalein通过调节TGF-β/SMAD、ERK1/2、P38 MAPK和NF-κB信号通路发挥抗炎作用，并已在多种炎症性疾病（如肺纤维化和肺动脉高压）中显示出治疗效果[1]。来自Glycyrrhiza uralensis的生物活性黄酮isoliquiritigenin通过调节NF-κB、MAPK、COX/LOX和JAK/STAT通路发挥治疗作用，从而减轻滑膜增生、保护软骨并恢复免疫平衡[2] [3]。此外，这些草药的联合使用可以增强协同效应。Lee等人证明Notopterygium incisum和Saposhnikovia divaricata的水提取物显著抑制了小鼠的TPA诱导的耳水肿，显示出降低IL-1水平的协同作用[4]。因此，系统地鉴定JWQHG的化学成分对于阐明其成分-效应关系至关重要。

已有几项研究报道了该配方中单个草药的化学成分。Wu等人系统地分析了Notopterygium incisum的化学成分和血浆代谢物，从中鉴定出62种化学成分和10种代谢物[5]。Huang利用UPLC-Q-TOF-MS/MS研究了Glycyrrhiza uralensis口服给药后大鼠体内的代谢物，分别在尿液、粪便和血浆中鉴定出21种、10种和14种代谢物[6]。尽管有这些关于单个草药的研究成果，但对JWQHG整体化学成分和代谢特性的研究仍然非常有限。Li等人使用UPLC-TQ-MS鉴定了JWQHG中的7种马兜铃酸成分[7]。Ren和Wang使用RP-HPLC鉴定了九味强藿口服液中的13种成分[8]。总之，对该配方化学成分的全面系统研究仍然缺乏，目前还没有关于JWQHG体内代谢途径的报道。不清楚的有效成分和代谢特性阻碍了对该配方的深入研究和二次开发。

中药中的天然产物成分会经历生物转化形成多种代谢物。对其代谢途径的系统研究对于药物的治疗效果、安全性评估和剂量优化至关重要。由于中药通常作用于多个靶点并可能影响多个代谢途径，高分辨率质谱（HRMS）通过提供准确的前体离子和次级碎片信息，可以为代谢物的结构推断提供可靠的信息。Kim等人对由Glycyrrhiza uralensis、Zingiber officinale和Aconitum carmichaeli组成的传统草药配方Sayeok-tang进行了全面的定性和定量分析，共鉴定出42种成分，其中24种成分在20分钟内同时被定量[9]。Xia等人使用HPLC-ESI-IT-MS和RRLS/ESI-Q-TOF-MS分析了蟾蜍毒素（Bufonis Venenum）的提取物、对照血浆和给药血浆，从中鉴定出20种原型成分和4种潜在的代谢物，为蟾蜍毒素的新药开发提供了宝贵参考[10]。鉴于中药的高化学复杂性和鉴定挑战，Stavrianidi系统地回顾了现有的LC-MS技术，并建立了一个基于分类的导航系统，包括元素组成测定、质量缺陷过滤、分子网络和诊断碎片离子筛选等核心模块，同时还对植物药物的代谢物谱进行了广泛研究[11]。尽管传统的LC-MS技术为中药成分分析和质量控制提供了坚实的科学基础，但它仍存在分辨率低和质谱计算精度不足等局限性，这往往导致未知化学成分的元素匹配不明确。因此，迫切需要一种通用方法，能够快速准确地鉴定中药制剂的成分。

超高效液相色谱与四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）是一种先进的技术，具有高选择性、高分辨率和高扫描速度。它已被广泛用于中药中复杂成分的快速鉴定，是鉴定中药和其他天然产物成分的理想选择。此外，通过串联质谱（MS/MS）检测特征性碎片信息，可以可靠地鉴定代谢物，适用于复杂处方中成分的全面鉴定和代谢物的分析。

在这项研究中，我们使用UPLC-Q-TOF-MS/MS快速筛选并鉴定了JWQHG的化学成分和代谢物。除了系统分析该配方的所有成分外，我们还阐明了JWQHG大鼠口服给药后的代谢途径，揭示了其生物学效应和可能的机制，并为JWQHG的质量控制和未来的药理学研究提供了参考。

化学物质和试剂

九味强藿颗粒（批号231101）购自中国成都的永康制药有限公司。质谱级甲酸、乙腈和甲醇由英国拉夫堡的Fisher Science提供。纯化水购自中国香港的Watson's Limited。

动物

从北京Vital River Biotechnology有限公司购买了6只体重为200±20克的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。动物实验方案已获得动物伦理委员会的批准

JWQHG提取物的制备

JWQHG样品被研磨成粉末。准确称取0.5克粉末，加入50毫升70%甲醇（甲醇:水=7:3，v/v），在35℃下进行超声提取30分钟。然后取上清液进行过滤分析。

灌胃液的制备

将JWQHG溶解在蒸馏水中，配制浓度为2克/毫升的灌胃液，然后在35℃下超声处理30分钟。

动物给药和样本收集

六只雄性SD大鼠被饲养在标准环境中（12小时光照/黑暗周期，室温20–25℃）

色谱条件

使用的色谱系统和柱子是ACQUITY UPLC H-Class UHPLC系统（美国马萨诸塞州米尔福德）和Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100毫米×2.1毫米，1.8微米）。柱温维持在40℃，流速为0.3毫升/分钟，进样量为3微升。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成。梯度洗脱程序如下：0-5分钟，5-20% B；5-8分钟，20-70% B；8-18分钟，70-90% B；18-20分钟，90-5%

JWQHG化学成分的鉴定

JWQHG在正负离子模式下的基峰强度色谱图如图1所示，JWQHG主要成分的中性丢失和特征碎片如图2所示。通过收集和整理文献建立了一个自建数据库，在JWQHG提取物中鉴定出144种成分（ppm≤10），包括43种香豆素、32种黄酮类、15种色酮类、17种有机酸、12种三萜类、5种氨基酸、2种生物碱和18种其他成分

结论

在这项研究中，我们建立了一种快速、可靠、灵敏和准确的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法，用于全面分析JWQHG的化学成分，并追踪其在大鼠口服给药后的体内代谢途径。在提取物中初步鉴定出144种化合物，包括43种香豆素、32种黄酮类、15种色酮类、17种有机酸、12种三萜类、5种氨基酸、2种生物碱和18种其他成分。JWQHG口服后

伦理声明

本动物实验已获得天津中医药大学实验动物伦理委员会的审查和批准，符合中国伦理委员会的指导原则。动物许可证编号为SCXK (Jing) 2021-0011，动物伦理许可证编号为TCM-LAEC2025283Y2045。

作者贡献声明

Mengjiao Zhou：验证、方法学。Yehan Zhu：验证、方法学。Hongfei Wu：验证、方法学。Jingyao Xia：验证、方法学。Mengru Wu：验证、方法学、概念化。Shenqi Sun：验证、方法学。Zihang Xu：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、验证、软件、方法学、调查、数据分析、概念化。Chen Zhou：撰写-审阅与编辑、验证、软件、数据管理

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号82204760、82574689）的支持。

利益冲突声明

不存在利益冲突。