时间序列聚类分析揭示了重症成人巨细胞病毒血症的显著模式

《Intensive Care Medicine Experimental》：Time-series clustering analysis reveals distinct patterns of cytomegalovirus viremia in critically ill adults

　　**摘要**

**背景**
危重患者巨细胞病毒（CMV）再激活的风险增加，这与较差的临床结果相关。然而，关于这一群体中病毒血症的纵向演变轨迹知之甚少。

**方法**
这项回顾性单中心研究在医学重症监护病房（ICU）进行，纳入了2014年3月至2021年4月期间CMV病毒血症≥1000国际单位/毫升全血（IU/mL）的患者。采用时间序列聚类方法识别具有相似病毒血症纵向演变轨迹的患者亚组。

**结果**
最终分析共纳入82名患者。时间序列聚类识别出三个不同的组：（1）初始病毒血症水平高的患者（中位数46,700 IU/mL），94%接受了治疗，并随后病毒血症显著下降；（2）病毒血症水平中等的患者（中位数2,720 IU/mL），病毒载量随后增加，其中52%接受了治疗；（3）病毒血症水平中等的患者（中位数3,120 IU/mL），63%接受了治疗，在随访测量中病毒载量保持稳定。在各组之间，包括潜在的免疫抑制状态在内的患者特征方面未发现显著差异。就疾病严重程度而言，急性生理和慢性健康评估II（APACHE-II）评分在组3中最高，在没有随访CMV-DNA测量的患者中也最高（P = 0.029），而序贯器官衰竭评估（SOFA）评分显示出类似的趋势，但未达到统计学显著水平。Kaplan-Meier估计显示各组之间的存活率存在显著差异（p = 0.008）；然而，所有组的1年绝对存活率均较低（组1：0%，组2：33%，组3：32%，无随访CMV测量的患者：14%；p = 0.062）。以呼吸系统症状为特征的疑似CMV肺炎和支气管肺泡灌洗液中检测到CMV-DNA是最常见的疾病表现（组1：35%；组2：28%；组3：7.5%；无随访CMV测量的患者：23%；p = 0.040）。

**结论**
在这项假设生成研究中，时间序列聚类分析确定了三个具有不同病毒血症纵向演变轨迹的亚组，这些亚组在病毒载量、治疗决策和随时间变化的存活率方面存在显著差异。ICU患者中病毒血症纵向演变轨迹的诊断和治疗相关性以及开始治疗的最佳CMV-DNA阈值尚不明确，可能与其他队列不同。

**背景**
危重患者巨细胞病毒（CMV）再激活的风险增加，这与较差的临床结果相关。然而，关于这一群体中病毒血症的纵向演变轨迹知之甚少。

**方法**
这项回顾性单中心研究在医学重症监护病房（ICU）进行，纳入了2014年3月至2021年4月期间CMV病毒血症≥1000国际单位/毫升全血（IU/mL）的患者。采用时间序列聚类方法识别具有相似病毒血症纵向演变轨迹的患者亚组。

**结果**
最终分析共纳入82名患者。时间序列聚类识别出三个不同的组：（1）初始病毒血症水平高的患者（中位数46,700 IU/mL），94%接受了治疗，并随后病毒血症显著下降；（2）病毒血症水平中等的患者（中位数2,720 IU/mL），病毒载量随后增加，其中52%接受了治疗；（3）病毒血症水平中等的患者（中位数3,120 IU/mL），63%接受了治疗，在随访测量中病毒载量保持稳定。在各组之间，包括潜在的免疫抑制状态在内的患者特征方面未发现显著差异。就疾病严重程度而言，急性生理和慢性健康评估II（APACHE-II）评分在组3中最高，在没有随访CMV-DNA测量的患者中也最高（P = 0.029），而序贯器官衰竭评估（SOFA）评分显示出类似的趋势，但未达到统计学显著水平。Kaplan-Meier估计显示各组之间的存活率存在显著差异（p = 0.008）；然而，所有组的1年绝对存活率均较低（组1：0%，组2：33%，组3：32%，无随访CMV测量的患者：14%；p = 0.062）。以呼吸系统症状为特征的疑似CMV肺炎和支气管肺泡灌洗液中检测到CMV-DNA是最常见的疾病表现（组1：35%；组2：28%；组3：7.5%；无随访CMV测量的患者：23%；p = 0.040）。

**结论**
在这项假设生成研究中，时间序列聚类分析确定了三个具有不同病毒血症纵向演变轨迹的亚组，这些亚组在病毒载量、治疗决策和随时间变化的存活率方面存在显著差异。ICU患者中病毒血症纵向演变轨迹的诊断和治疗相关性以及开始治疗的最佳CMV-DNA阈值尚不明确，可能与其他队列不同。

**背景**
巨细胞病毒（CMV）是一种普遍存在的疱疹病毒，在成人中的血清阳性率很高[1, 2]。初次感染后，该病毒处于潜伏状态，可能在系统性炎症或免疫功能下降的情况下重新激活[3, 4, 5]。由于免疫调节异常，重症监护病房（ICU）中的危重患者CMV再激活的风险增加[4, 6, 7]。多项研究表明，CMV再激活和高病毒载量与ICU患者的不良临床结果相关[7, 8, 9]。然而，目前尚不清楚CMV再激活是导致不良结果的因素还是仅反映了炎症和疾病严重程度[9, 10, 11]。在没有疾病表现的情况下，CMV再激活时开始抗病毒治疗的阈值因患者群体和机构而异。在免疫功能低下的患者中，例如器官移植（SOT）或异基因造血干细胞移植（HSCT）后，通过监测CMV病毒载量并采取预防性治疗是公认的做法[12, 13]。对于没有CMV疾病的非免疫抑制ICU患者，抗病毒治疗的好处仍存在争议，因为无论是对于CMV-DNA病毒血症的患者进行“预防性”治疗，还是对CMV-IgG血清阳性的个体进行“预防性”治疗，均未改善临床结果[14, 15]。尽管存在持续争论，但关于危重患者病毒血症的纵向演变轨迹知之甚少，实际关于有和没有抗病毒干预情况下CMV病毒血症演变的数据也非常有限[15]。本研究旨在回顾性评估不同CMV病毒轨迹的预后意义，并阐明抗病毒治疗对这些病毒学模式的影响。

**方法**
我们在一家三级大学的医学ICU进行了这项回顾性单中心研究（2014年3月至2021年4月）。符合条件的患者是在ICU住院期间通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测到病毒载量≥1000国际单位/毫升（IU/mL）的CMV病毒血症患者。qPCR分析使用Roche Diagnostics公司的LightCycler? 480仪器根据制造商的说明进行。我们ICU中进行CMV-DNA检测的指征包括：（1）对严重免疫抑制患者进行常规监测，这些患者在接受器官移植（SOT）或异基因造血干细胞移植（HSCT）后每两周检测一次；（2）对获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者进行 targeted 测试，这些患者由于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染而被确认，以及对怀疑患有噬血细胞组织细胞增多症（HLH）的患者进行测试；（3）对非免疫抑制患者进行个体诊断测试，这些患者出现持续发热或尽管进行了全面的微生物学和病毒学诊断及适当的医学影像学检查，但仍无法确定感染灶或致病菌。在后一组中，CMV-DNA检测的时间和指征并不标准化，由医生决定。为了分析病毒血症的纵向演变轨迹，仅纳入了在ICU住院期间至少有一次后续CMV-DNA检测的患者。患者群体包括接受针对CMV的抗病毒治疗的患者和仅进行了后续CMV-DNA监测而未接受治疗的患者。为了分析抗病毒治疗对病毒血症纵向轨迹的影响，仅纳入了在CMV病毒血症发生后±3天内开始针对CMV的抗病毒治疗的患者。选择±3天的时间窗口是为了反映高风险患者的当地每周两次监测惯例，并确保病毒血症检测和治疗开始之间的时间接近性。从医疗记录中提取了人口统计信息、合并症、免疫抑制状态、实验室数据、ICU干预措施、抗病毒治疗和结果。免疫抑制根据英国卫生安全局的《绿色指南》中的标准定义。病毒血症 Based on 连续的CMV-DNA PCR结果进行纵向评估，排除了普通病房的随访测量结果。根据CMV论坛的共识标准，定义了确诊和可能的CMV疾病[16]。简而言之，确诊的器官末端疾病需要符合临床表现并在受影响组织中直接检测到CMV，例如通过组织病理学、病毒分离或快速培养。可能的器官末端疾病可以基于器官组织中的CMV-DNA水平推断，例如在可能的CMV肺炎情况下，在支气管肺泡灌洗液中检测到CMV-DNA。抗病毒治疗定义为给予更昔洛韦、缬更昔洛韦或福沙那韦的治疗剂量。

**统计分析**
所有分析均使用R版本4.5.0（ZB：用于统计计算的R语言和环境。R基金会，维也纳，奥地利。https://www.R-project.org/）和RStudio（R版本2025.5.0.496；RStudio公司，波士顿，美国）进行。连续变量以中位数和四分位数范围（IQR；Q1, Q3）表示，而分类变量以绝对数和百分比[n (%)]表示。使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量，使用Pearson卡方检验或Fisher精确检验比较分类变量。生存率使用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验分析。显著性阈值设定为p < 0.05。为了便于患者之间的比较，病毒载量值进行了对数和z转换。使用R包中的“tsclust”进行时间序列聚类，以识别具有相似病毒血症动态的亚组。聚类采用分区方法，根据患者病毒血症纵向轨迹的相似性进行分组。使用动态时间弯曲（DTW）距离量化轨迹之间的相似性，该距离允许模式的时间偏移（例如，峰值出现在略有不同的时间）。每个簇由DTW质心平均（DBA）计算的质心表示，提供了代表整个簇内的时间模式的轨迹。这种方法允许比较采样频率和时间不同的患者，这在回顾性ICU数据集中很常见。最初使用内部聚类有效性指标（特别是平均轮廓宽度和Davies-Bouldin指数）探索了最佳簇数。

**结果**
在140名CMV病毒血症≥1000 IU/mL的ICU患者中，27名被排除（7名因记录不完整，20名因抗病毒治疗在预定义的±3天时间窗口之外开始）。82名患者被纳入聚类分析，而31名患者没有后续CMV-DNA测量，被归类为“无簇”组。平均轮廓宽度和Davies-Bouldin指数最常支持两簇解决方案，反映了总体病毒负担的主导分离；然而，在不同的初始化和簇解决方案中，这些指数并未一致地确定唯一的最优簇数，偶尔支持三簇结构。对纵向轨迹的检查显示，中度病毒血症范围内的患者一致表现出两种明显且可重复的时间模式，即病毒扩增和病毒持续存在，这两种模式在两簇解决方案中合并。鉴于研究的探索性质以及中度病毒血症范围内存在两种可重复和临床明显的动力学模式，尽管内部有效性指数的支持较少，仍选择了三簇解决方案。识别的簇在图1a中展示。个别患者的聚类病毒血症轨迹在补充图1中展示。总结来说，簇1包括初始病毒载量高的患者群体，大多数病毒载量超过10,000 IU/mL，随后病毒载量下降。簇2和簇3包括病毒血症水平中等的患者，通常在1,000至10,000 IU/mL之间。在这个亚组中，簇2的患者病毒载量随后增加，而簇3患者在随访测量中显示病毒载量相对稳定。

**表1** 不同簇的患者基线特征和结果列在表1和补充表1中。不同簇之间的初始病毒载量（p < 0.001）和针对CMV的抗病毒治疗存在显著差异，高病毒血症簇1中的大多数患者接受了抗病毒治疗（94%），而中度病毒血症簇2和簇3中大约一半的患者接受了治疗（簇2：52%；簇3：63%；“无簇”组：52%；p = 0.019）。关于疾病严重程度，急性生理与慢性健康评估II（APACHE-II）评分在第三组中显著更高，中位数为22（四分位数1-四分位数3，16-26），而在“无分组”组中中位数为21（16-27），相比第一组和第二组的中位数18（p = 0.029）。相比之下，序贯器官功能衰竭评估（SOFA）评分显示出类似的趋势，但没有达到统计学显著性。所有接受抗病毒治疗的患者都使用了更昔洛韦。在各组之间，确诊或疑似CMV疾病的总体发病率没有显著差异。伴有呼吸系统症状的疑似CMV肺炎以及在支气管肺泡灌洗液中检测到CMV-DNA是最常见的CMV疾病表现形式，并且在第一组中的发病率显著更高（第一组：6例（35%）；第二组：7例（28%）；第三组：3例（7.5%）；“无分组”组：23%；p = 0.040）。确诊或疑似胃肠道疾病是第二常见的CMV疾病表现形式（第一组：1例（5.9%）；第二组：2例（8.0%）；第三组：6例（15%）；“无分组”组：13%；p = 0.8）。不同组的Kaplan-Meier分析如图1b所示，显示各组之间的生存时间有显著差异（p = 0.008），其中“无分组”组的生存概率最低。总体而言，三个组的1年生存率均较低（分别为0%、33%和32%）。

表1：重症监护病房（ICU）中CMV病毒载量≥1,000 IU/mL的患者特征，包括是否接受针对CMV的抗病毒治疗（治疗开始时间±3天病毒载量），按病毒载量的纵向轨迹分组。

图1c展示了第二组和第三组患者的病毒载量纵向轨迹，这两组在抗病毒治疗与不进行抗病毒治疗的患者分布上大致相当。所有可获得的资料中，包括没有进行病毒载量纵向评估的患者，接受了抗病毒治疗与未接受抗病毒治疗的患者进行了比较，相关数据列在补充表1和表2中，Kaplan-Meier分析见补充图2。此外，在这个总体组中，包括没有接受随访病毒载量评估的患者（n = 113），未观察到抗病毒治疗组与未接受抗病毒治疗组在临床结果参数上有显著差异。

**讨论**
CMV病毒载量在重症成人中常见，但其预后意义和最佳管理方法仍不确定。这项假设生成的研究使用时间序列聚类方法识别了ICU患者中的三种不同的CMV病毒载量轨迹，在基线病毒载量、治疗决策以及Kaplan-Meier估计的生存时间方面存在显著差异。然而，这些观察结果也突显了当前关于ICU患者无CMV疾病时治疗阈值和治疗指征的策略的不确定性。
主要 distinguishes 一个亚组，其特征是初始病毒载量高且病毒迅速减少，几乎所有患者都接受了抗病毒治疗（图1a）。尽管与其他亚组相比，在免疫抑制患者比例或移植后患者和HIV患者亚组中未观察到显著差异，但未提供关于免疫抑制强度或具体免疫抑制方案的详细信息。根据非ICU移植人群的数据，可以推测免疫抑制的程度和免疫抑制治疗的类型也可能在重症ICU患者的CMV再激活中起关键作用[17,18,19]。有趣的是，由APACHE-II评分表示的疾病严重程度在后续测量中病毒载量相对稳定的组（第三组）以及没有进行后续测量的患者中较高，而不是在高病毒载量组（第一组）中。虽然疾病严重程度与CMV再激活的发病率相关，这一点最近通过将APACHE-II评分确定为CMV再激活的独立风险因素得到了强调[20]，但在ICU患者中尚未证明疾病严重程度与CMV病毒载量之间存在明确的相关性。因此，CMV再激活而非病毒载量被提作重症严重程度的替代标志物[21]。
然而，HIV和移植患者的数据表明，高病毒载量与较差的预后和并发症相关[9, 22,23,24,25]。此外，在当前数据中，高病毒载量组在Kaplan-Meier估计中的生存时间较短，只有没有进行随访测量的患者预后更差。
鉴于较高的死亡率以及病毒载量中位数比其他组高出十多倍，第一组中医生开始抗病毒治疗的限制似乎较低。在病毒载量迅速下降的高病毒载量组中，94%的患者接受了治疗，而在病毒载量中等的组中，只有大约一半的患者接受了治疗。这一组中预防性治疗的开始可能是基于免疫功能低下患者的数据，这些数据显示抗病毒治疗能有效预防组织侵袭性疾病[26,27,28]。在当前分析中，最常见的CMV疾病表现形式是疑似CMV肺炎，最近的研究表明，下呼吸道的受累与重症患者的不良预后相关[8]。在高病毒载量组中，超过三分之一的患者出现了疑似CMV肺炎，其特征是呼吸系统症状和支气管肺泡灌洗液中检测到CMV-DNA。需要注意的是，CMV肺炎的诊断标准最初是为免疫功能低下患者群体建立的，在这些患者中，临床相关感染的预设概率显著增加[29]。在这些标准的最新修订中，支气管肺泡灌洗液中的CMV-DNA拷贝数阈值得到了细化[29]。由于当前分析中没有CMV-DNA水平的定量数据，不能排除某些情况下检测到的病毒DNA反映了无症状病毒脱落的可能性。
关于抗病毒治疗，ICU患者的数据较为有限。Papazian及其同事在机械通气ICU患者中进行的一项随机临床试验中，由于需要大量患者才能显示出差异，因此基于数据安全监测委员会的中期分析提前终止了研究，这些患者的CMV再激活值>500 IU/mL。尽管对76名随机患者（39名接受更昔洛韦治疗，37名接受安慰剂治疗）的分析显示，预先使用更昔洛韦并未改善临床结果，但统计功效不足，无法对是否预先使用更昔洛韦提出明确建议[14]。此外，在Limaye及其同事进行的安慰剂对照随机临床试验中，将更昔洛韦作为预防剂用于CMV血清阳性ICU患者并未降低血浆白细胞介素6（IL-6）水平从基线到第14天的变化这一生物学主要终点。作为次要结果，更昔洛韦组的CMV再激活显著较低，而其他次要结果无显著差异。重要的是，该研究也没有能力识别次要临床结果中的差异[15]。尽管在高病毒载量亚组中观察到病毒载量下降，但研究设计无法将这种下降归因于抗病毒治疗。此外，在免疫功能低下的非ICU患者中，关于何时开始预防性治疗的适当阈值存在争议，不同研究中的推荐也各不相同[30,31,32]。ICU患者的数据更加有限，缺乏预防性治疗的阈值，这反映在只有大约一半的中等病毒载量患者接受了抗病毒治疗。描述性地来看，ICU中首次CMV病毒载量≥1000 IU/mL后的前几天，CMV病毒载量的纵向趋势似乎因治疗不同而有所不同（图1c）。这些发现似乎强调了这样一个观点：对于没有疾病表现的ICU患者，抗病毒治疗需要仔细权衡潜在的副作用，如骨髓抑制或肾病。还应考虑到，这些情况下的针对性抗病毒治疗可能主要降低病毒载量，而不会显著影响这些重症患者的潜在病理生理过程。
这项分析有几个重要的局限性。首先，回顾性研究设计、样本量有限以及缺乏组织学或尸检样本限制了因果推断，并排除了关于ICU患者CMV病毒载量的结论。特别是，关于CMV随访测量和治疗的临床管理决策并未标准化，这引入了显著的选择偏差。重要的是，聚类策略基于观察到的CMV病毒载量动态，而这些动态本身受到临床决策的影响，从而增加了信息审查和治疗诱导轨迹的风险。由于CMV病毒载量的动态受到临床决策的影响——特别是抗病毒治疗开始的时间——这些轨迹可能无法准确反映CMV再激活的自然史。ICU入院前缺乏CMV病毒载量的数据进一步复杂化了解释，因为入院前的病毒载量发作和持续时间未知，限制了对完整病毒轨迹的评估。此外，不是所有患者都有CMV血清状态数据，无法明确区分CMV再激活和原发感染。最后，分析未能提供足够的数据来确定是否开始抗病毒治疗影响了临床表现的CMV疾病的发展，而仅作为一项假设生成的研究。
综上所述，我们的发现表明，在患有CMV病毒载量的重症患者中可以区分出三个不同的组别。初始病毒载量显著升高的患者生存率最低，疑似CMV肺炎的发病率最高。几乎所有这些患者都接受了抗病毒治疗，反映了临床医生的担忧。病毒载量中等的两个组显示出的病毒动态不同（增加 vs. 稳定），但结果相似。抗病毒治疗的使用不一致，且短期病毒动态无显著差异。这些发现强调，目前ICU患者中启动治疗的CMV-DNA阈值以及治疗本身的效果尚不确定，支持病毒负担可能主要反映疾病严重程度而非可改变的致病因素的假设。这项研究可以为未来的前瞻性研究提供基础，这些研究将使用预定义的采样方案和独立的验证队列，进一步探讨所识别病毒轨迹的预后和治疗相关性。