综述：利用基因组编辑技术推进鸡的免疫力与抗病性

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Advancing immunity and disease resistance in chickens through genome editing

　　

家禽是为大量人类提供食物的主要营养来源。传染病威胁着家禽群体的生产力并损害动物福利。基因组编辑的最新进展显著促进了我们对各种生理方面的理解，并有助于阐明鸡宿主与病原体之间的相互作用。研究人员构建了多种鸡品系，包括I型和III型干扰素受体敲除、缺乏特异性T细胞群体以及缺失V(D)J重组贡献因子（如重组激活基因1，RAG1）的品系。此外，研究人员通过靶向酸性核磷蛋白实现了对禽流感病毒（AIV）的抗性。最后，在鸡中恢复视黄酸诱导基因I（RIG-I）和环指蛋白135（RNF135）的表达揭示了其进化作用的新见解，特别是在与AIV的宿主-病原体相互作用期间。本综述提供了关于鸡基因组编辑最新成就的更新，特别是在免疫学和抗病性方面。

利用体外方法开展的基础研究

体外模型在鸡免疫研究中持续提供有价值的数据。研究人员利用原代输卵管细胞和DF-1细胞系（一种自发永生化的鸡成纤维细胞系）评估了新型重组启动子的效力，并证实了CRISPR激活或抑制系统在转录研究中的有效性。利用HD11细胞系（源自鸡骨髓的巨噬细胞系）进行的转录组学分析表明，敲低或过表达受体相互作用蛋白激酶2（RIPK2）会引起细胞外基质（ECM）-受体相互作用、局灶性粘附和转化生长因子（TGF）-β信号通路等分子事件的变化。此外，感染球虫后的HD11细胞显示出超过240个差异调节基因，包括Toll样受体15（TLR15）和NOD样受体家族CARD结构域蛋白5（NLRC5）。近期研究发现鸭胚胎细胞中存在干扰素调节因子3（IRF3）和IRF9，这推翻了此前认为鸟类缺乏这些因子的观点，并证实其对干扰素介导的反应至关重要。在DF-1细胞中过表达哺乳动物的粘病毒抗性（Mx）基因可显著降低禽流感病毒（AIV）的复制。然而，研究也指出DF-1细胞因高表达细胞因子信号抑制因子1（SOCS1），其免疫反应弱于原代鸡胚成纤维细胞（CEFs），因此在解释数据时应谨慎。总体而言，体外研究虽支持3R原则，但其数据仍需体内研究来验证复杂的适应性免疫系统互作。

通过比较发病机理揭示宿主-病原体相互作用的新见解

比较水禽与陆禽的差异有助于改进预防策略。研究表明，鸭胚胎成纤维细胞对水禽博纳病毒1（ABBV-1）和减蛋综合征（EDS）病毒的易感性显著高于鸡细胞。针对高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1的研究发现，鸡内皮细胞在促炎细胞因子风暴中起关键作用，而鸭内皮细胞受感染程度较低。在感染H5N1后，鸭体内会诱发强烈的CD8⁺T细胞反应。对不同基因型H5N6病毒的比较显示，其内部基因构成决定了病毒在哺乳动物细胞与水禽间的复制偏好。跨物种蛋白质组学分析揭示了嗅觉素4（OLFM4）、α-1,4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶（A4GNT）等差异调节基因，推测强烈的神经炎症反应可能是导致易感性的主要因素。综上所述，比较发病机理结合差异基因分析为增强鸡的免疫系统提供了理论基础。

利用转基因技术探索禽类免疫系统

鸡一直是免疫学研究的重要模型。早在2006年实现原始生殖细胞（PGCs）的长期培养与遗传修饰后，鸡的转基因研究取得了飞跃。特别是CRISPR/Cas9技术的引入，使得构建特定基因敲除鸡系成为可能。研究人员成功构建了RAG1敲除鸡，证实了其在V(D)J重组及成熟T、B细胞发育中的关键作用，并借此鉴定出鸡体内保守的自然杀伤（NK）细胞亚群。针对T细胞受体的研究通过同源定向修复（HDR）技术分别敲除了αβ或γδ T细胞的恒定区，结果表明αβ T细胞的缺失会导致严重的免疫表型，伴有肉芽肿和炎症，而γδ T细胞的缺失则会增加肠道αβ T细胞的可用性，且在抗马立克氏病病毒（MDV）感染中发挥关键保护作用。此外，通过构建XCR1-iCaspase9-RFP鸡系，研究人员可视化并消融了XCR1⁺常规树突状细胞（cDCs），发现XCR1的缺失阻碍了cDCs与CD8⁺T细胞的聚类。最新的I型和III型干扰素受体（IFNAR和IFNLR）敲除鸡模型揭示了干扰素在抗体产生、免疫细胞群调控及针对不同亚型流感病毒株的菌株特异性作用。

从抗性或不易感物种中学习

利用CRISPR/Cas9系统模拟不易感物种的天然突变是获得抗病性的有效途径。通过诱导鸡Na⁺/H⁺交换体1（chNHE1）的单氨基酸突变，成功使鸡对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）产生抗性。针对马立克氏病病毒（MDV），靶向感染细胞多肽4（ICP4）的转基因鸡表现出显著较低的病毒复制率。然而，针对RNA病毒（特别是AIV）的靶点识别更具挑战性。近期研究聚焦于酸性核磷蛋白32家族（ANP32），通过编辑ANP32A基因或完全敲除，在低剂量H9N2攻毒下实现了保护，但在高剂量攻毒下病毒会发生适应性突变，转而利用编辑后的ANP32或宿主其他的ANP32B/E蛋白。值得注意的是，恢复鸡体内本已进化丢失的视黄酸诱导基因I（RIG-I）及其泛素化因子RNF135的研究揭示了复杂的病理机制：单纯表达RIG-I会导致H3N1和H7N1感染后引发致命的过度炎症反应，而共表达RNF135虽能降低病毒复制，但仍伴随急性炎症反应和高死亡率。这表明鸭作为病毒储存库的独特机制不仅仅依赖于RIG-I的存在。

针对禽流感的抗性鸡：现状与局限

由于宿主因子难以确定且病毒突变率高，培育抗AIV鸡面临巨大挑战。流感病毒A拥有8个基因节段，其高突变率（平均每基因组2-3个突变）极易导致逃逸突变体的出现。尽管水禽通常症状较轻，但某些HPAIV（如H5N8）也能引起野鸟和家禽的高死亡率，这与血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）和非结构蛋白1（NS1）等多个因子有关。目前基于ANP32A的编辑策略虽然有效，但研究表明要实现无菌免疫可能需要多基因修饰，因为病毒能够适应并利用宿主其他代偿性蛋白。未来的研究方向可能包括靶向参与病毒蛋白（如HA）生物合成的细胞因子信号肽酶复合体（Sec61），通过干扰病毒蛋白稳态来限制感染。

结论与未来展望

自CRISPR/Cas9发现以来，家禽生物技术工具的空白正被填补。PGCs的长期培养与遗传修饰使得构建多种基因工程鸡系成为可能，这些模型不仅服务于免疫学研究，也为预防疾病提供了新方案。未来的研究应进一步利用鸡作为比较发病机理的模型，深入理解宿主-病原体互作的机械论及进化机制。面对持续的H5N1健康风险，基于基因组编辑的新策略（如多基因编辑）和新型递送工具（如病毒样颗粒VLPs疫苗）至关重要。同时，公众对转基因动物产品的接受度仍将是一个长期议题，但通过精准模拟自然界中“天然”发生的抗性突变，或许能为这场辩论提供可行的解决方案。