通过生物纳米工厂Penicillium crustosum实现壳聚糖纳米颗粒的创新合成：优化、表征及其在对抗建筑物降解真菌Trichosporon asahii中的应用

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Innovative mycosynthesis of chitosan nanoparticles via bionanofactory Penicillium crustosum: optimization, characterization, and application against building-deteriorating fungus, Trichosporon asahii

　　

建筑材料的生物腐蚀是全球性挑战，威胁现代建筑与文化遗产。这种退化主要由微生物（尤其是真菌）与人为活动产生的含氮、硫、碳气溶胶的相互作用驱动，导致建筑表面渐进式生物腐蚀。因此，本研究旨在利用壳聚糖纳米颗粒（CNPs）减轻此类有害影响。研究采用生态友好的生物合成方法，利用青霉菌（Penicilliumsp.）HNSAM-7菌株的无细胞上清液生产CNPs。通过ITS区域序列分析及形态特征，该菌株被鉴定为Penicillium crustosumHNSAM-7。CNPs的理化性质表征显示：扫描电子显微镜（SEM）与透射电子显微镜（TEM）分析表明，生物合成的CNPs呈球形、表面光滑且尺寸不一，平均粒径为26.19 nm；X射线衍射（XRD）证实其结晶性质；傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测到O–H、-NH2、CH、CH2、CONH2、C–O、C–OH、C–O–C、–C≡CH、O＝S＝O、NH、C–O等多种官能团；CNPs表面带正电荷，Zeta电位值为＋26.2 mV。随后，研究人员采用面心中心复合设计（FCCCD）最大化CNPs产量，在壳聚糖浓度1.19%（w/v）、初始pH 4.99、无细胞上清液体积分数99.94%（v/v）条件下，获得最大产量10.71 mg/mL。通过杀灭时间试验评估了CNPs对Trichosporon asahii的体外杀真菌活性，较高浓度（250和500 μg/mL）的CNPs表现出显著杀真菌活性；SEM分析显示，孢子与菌丝结构受损，包括生物膜结构破坏。这些发现表明，生态友好的生物合成CNPs有望作为生物安全涂层，保护建筑结构免受微生物腐蚀。

论文解读

研究背景与意义

建筑材料的生物腐蚀受物理化学因素（如降雨、温度波动、湿度）与微生物（尤其是真菌）共同作用，人为污染物（含氮、硫、碳气溶胶）进一步加剧这一过程，导致石材、水泥等材料变色、矿物失稳及结构损坏，威胁现代建筑与文化遗产（如吉萨金字塔、佛罗伦萨大教堂）。传统化学合成CNPs存在毒性高、能耗大、颗粒尺寸不均等问题，而绿色合成方法（利用真菌、植物等天然来源）因环境友好、生物相容性高成为研究热点。本研究首次探索利用Penicillium crustosumHNSAM-7无细胞上清液作为天然交联剂与稳定剂合成CNPs，并通过FCCCD优化产量，评估其对建筑降解真菌Trichosporon asahii的抑制效果，为开发建筑用生物安全抗菌涂层提供理论与技术支撑。论文发表于《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》。

关键技术方法

研究主要采用以下技术：分子生物学方法（ITS区域测序与邻接法构建系统发育树鉴定菌株）；纳米材料表征技术（UV–可见分光光度计测吸收光谱，SEM/TEM观察形貌与尺寸，能量色散X射线光谱（EDX）分析元素组成，XRD检测结晶性，FTIR识别官能团，Zeta电位仪测定表面电荷，热重分析（TGA）与差示扫描量热法（DSC）评估热稳定性）；实验设计方法（FCCCD优化CNPs合成条件）；微生物学方法（杀灭时间试验结合动态活菌计数评估杀真菌活性，SEM观察真菌超微结构损伤）。

研究结果

1. Penicilliumsp. HNSAM-7的宏观与微观特征

菌落呈灰绿色、絮状，背面黄橙色；SEM显示其分生孢子梗粗糙、帚状枝双轮生，分生孢子球形、壁光滑，结合ITS序列（GenBank登录号OR783158）与系统发育分析，鉴定为Penicillium crustosumHNSAM-7。

2. CNPs的生物合成与UV–可见光谱

利用菌株无细胞上清液与壳聚糖溶液混合产生浑浊，UV光谱显示CNPs最大吸收波长251 nm（壳聚糖为231 nm），证实CNPs形成。

3. CNPs的电子显微镜观察

SEM（40000×）显示CNPs呈球形、表面光滑、分散性好；TEM（500 nm尺度）显示粒径5–17 nm，平均26.19 nm，较传统方法（如离子凝胶法）粒径更小且均匀。

4. 能量色散X射线（EDX）分析

EDX检测到C、O、N、H等壳聚糖特征元素，分布均匀，验证CNPs结构稳定性。

5. X射线衍射（XRD）

XRD图谱显示CNPs在2θ＝11.8°、25.36°处有特征峰，对应（020）水合结构与（110）无水几丁质晶面，Scherrer公式计算晶粒度约5.5 nm，表明真菌提取物促进纳米晶结构形成。

6. Zeta（ζ）电位分析

CNPs的ζ电位为＋26.2 mV，表面带正电荷，源于壳聚糖质子化氨基（-NH₃⁺），可增强与带负电微生物膜的相互作用，PDI值0.454表明颗粒分布中等均一。

7. 傅里叶变换红外（FTIR）光谱

FTIR检测到O–H（3427.62 cm^?1）、-NH₂（1635.69 cm^?1，酰胺I带）、C–O（1084.99 cm^?1）等官能团，峰位偏移表明真菌代谢物与壳聚糖发生交联反应。

8. CNPs的热行为

TGA显示CNPs在141.68–366.88 °C失重45.03%（主降解阶段），800 °C残留质量约18%，DSC证实其热稳定性较纯壳聚糖提升，归因于交联增强网络刚性。

9. FCCCD优化CNPs产量

通过FCCCD建立二次回归模型，确定最佳合成条件：壳聚糖浓度1.19%（w/v）、初始pH 4.99、无细胞上清液体积分数99.94%（v/v），此时CNPs产量达10.71 mg/mL。

10. CNPs对Trichosporon asahii的杀真菌活性

杀灭时间试验显示，250–500 μg/mL CNPs处理120 h后，活菌数降低≥3 log₁₀CFU/mL，符合杀真菌定义；动力学模型拟合得速率常数K为负值，证实浓度依赖性杀菌效应；SEM观察到孢子皱缩、菌丝断裂及生物膜结构破坏。

结论与讨论

研究结论表明，利用Penicillium crustosumHNSAM-7无细胞上清液绿色合成的CNPs具有粒径小（平均26.19 nm）、结晶度高、表面带正电（ζ＝＋26.2 mV）及良好热稳定性等特点，通过FCCCD优化后产量显著提升（10.71 mg/mL）。其对建筑降解真菌Trichosporon asahii表现出强杀真菌活性，作用机制与破坏真菌细胞膜及生物膜结构相关。该CNPs合成方法避免了化学交联剂的毒性，符合绿色建筑防护材料的需求，为保护现代基础设施与文化遗产免受微生物腐蚀提供了新型生物安全策略。