《BMC Chemistry》：The first validated HPLC method with UV detection for concurrent assay of lidocaine and fluorescein in their co-formulated ophthalmic solution
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建立并验证了一种简便、快速且环境友好的反相高效液相色谱（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP?HPLC）方法，用于利多卡因（lidocaine）与荧光素（fluorescein）的同步
建立并验证了一种简便、快速且环境友好的反相高效液相色谱（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP?HPLC）方法，用于利多卡因（lidocaine）与荧光素（fluorescein）的同步定量测定，采用紫外（Ultraviolet，UV）检测器，检测波长220 nm。色谱分离在等度洗脱条件下进行，使用Inertsil?C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，3.5 μm粒径），以乙腈与含0.3%三乙胺（Triethylamine，TEA）的水溶液（用磷酸调至pH 3.5）按体积比75:25（v/v）混合作为流动相，恒流率1.0 mL/min。研究人员按国际人用药品注册技术要求协调会（International Council for Harmonisation，ICH）指导原则对方法进行验证，证实该方法准确、精密、稳健，且在利多卡因20–280 μg mL?1、荧光素1–20 μg mL?1浓度范围内呈良好线性。检出限（Limit of Detection，LOD）分别为利多卡因5.27 μg mL?1、荧光素0.29 μg mL?1；定量限（Limit of Quantitation，LOQ）分别为15.97 μg mL?1和0.88 μg mL?1。研究人员将该法应用于复方眼科制剂中两成分的含量测定，利多卡因平均回收率为100.80 ± 0.67%，荧光素为100.13 ± 0.99%，表明其适用于常规质量控制。采用分析生态标尺（Analytical Eco?Scale）、绿色分析程序指数（Green Analytical Procedure Index，GAPI）及分析绿色度指标（Analytical GREEnness，AGREE）评价方法环境影响，Eco?Scale得分为78，AGREE得分为0.63，基于定量评估显示具可接受的绿色度。
本文解读基于发表于《BMC Chemistry》的文献：The first validated HPLC method with UV detection for concurrent assay of lidocaine and fluorescein in their co-formulated ophthalmic solution。
研究背景：盐酸利多卡因（lidocaine hydrochloride）为酰胺类局部麻醉药，荧光素钠（fluorescein sodium）为眼科诊断用染色剂，二者常复配于眼用制剂（如眼压测量前用药）。已有文献分别报道了各自单独测定的紫外-可见分光光度法、荧光光谱法、液相色谱（HPLC）、气相色谱、毛细管电泳及电化学方法，也有报道二者分别与其它药物联用的HPLC测定法，但尚无经正式验证的可同时测定利多卡因与荧光素复方眼科溶液中两活性成分的HPLC方法。为保证复方制剂的质量、疗效与安全性，有必要建立选择性好、效率高的同步定量分析方法。此外绿色分析化学（Green Analytical Chemistry，GAC）提倡降低试剂消耗与废物产生，亦需在方法开发中予以考量。
研究人员开发并验证了使用紫外（UV）检测的RP?HPLC方法，用于同步测定利多卡因与荧光素钠复方滴眼液中的两活性组分，并在ICH Q2(R1)框架下完成全面方法学验证，同时采用Analytical Eco?Scale、GAPI及AGREE工具评价方法的绿色度，证实该方法简便、准确、精密、稳健且具可接受的环境友好性，适用于日常质量控制。
主要关键技术方法：研究人员使用Dionex UltiMate?3000 RS HPLC系统，Inertsil?C18柱（250 mm × 4.6 mm，3.5 μm），以乙腈–0.3% TEA（pH 3.5，H3PO4调节）75:25（v/v）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，UV检测波长220 nm。用利多卡因HCl与荧光素钠对照品配制系列标准溶液绘制校准曲线，实验室自制含聚维酮（povidone）的模拟复方滴眼液（利多卡因HCl 4% w/v、荧光素钠0.25% w/v，pH 7.4）为供试品。按ICH指南评价线性、范围、LOD、LOQ、准确度（加标回收）、精密度（重复性与中间精密度）、稳健性（有机相比例±2%、pH ±0.1、流速±0.2 mL/min、柱温±2 ℃）及系统适用性；以空白辅料对照与PDA全波长扫描考察选择性；以Eco?Scale、GAPI五边形图和AGREE圆盘评分评价绿色度。
研究结果：
优化色谱条件（Optimization of the chromatographic conditions）：研究人员比较了乙醇、甲醇和乙腈作有机相，乙醇与甲醇致峰形宽、保留时间长，乙腈提供尖锐对称峰且分析时间短，故选乙腈。水相比较乙酸铵缓冲液（荧光素不洗脱）、磷酸盐缓冲液（峰拖尾、肩峰）后选用0.3% TEA水溶液（荧光素峰形佳）。TEA浓度筛选0.1%–0.5%，0.3%时峰拖尾最小，更高浓度无进一步改善。水相pH于3–7间考察，pH 3.5时利多卡因完全质子化早洗脱、荧光素酚羟基基本未电离晚洗脱且峰形好、达基线分离；pH升高致荧光素部分电离产生多重离子态，峰分裂、拖尾及出峰顺序反转，故选定pH 3.5。乙腈比例由90%渐降至70%，75%乙腈时两峰均对称且达基线分离（90%共洗脱，70%有利多卡因肩峰），确定为最优比例。柱温25–40 ℃考察，升温致利多卡因峰展宽，故选25 ℃。最终条件下利多卡因与荧光素获良好分离与对称峰形。
分析性能与方法验证（Analytical performance and validation of the proposed method）：线性范围利多卡因20–280 μg mL?1、荧光素1–20 μg mL?1，回归显示相关系数良好。LOD为利多卡因5.27 μg mL?1、荧光素0.29 μg mL?1；LOQ为利多卡因15.97 μg mL?1、荧光素0.88 μg mL?1。准确度试验三浓度水平加标回收：利多卡因平均回收100.80 ± 0.67%，荧光素100.13 ± 0.99%。日内与日间精密度RSD均＜2.0%。稳健性试验中微调乙腈比例（±2%）、pH（±0.1）、流速（±0.2 mL/min）及柱温（±2 ℃），回收率RSD＜2.0%，表明方法对微小变动不敏感。系统适用性参数（保留时间、分离度、理论塔板数、不对称因子）均符合可接受标准。
实验室制备滴眼液的分析（Analysis of the laboratory?prepared ophthalmic solution）：将方法用于自制模拟复方滴眼液（含聚维酮辅料），样品色谱图与同浓度标准混合溶液一致，辅料在利多卡因与荧光素保留时间处无干扰峰。六次重复测定平均回收率为利多卡因100.80 ± 0.67%、荧光素100.13 ± 0.99%，表明方法在赋形剂存在下具特异性与准确性。
色谱选择性评价（Evaluation of chromatographic selectivity）：空白辅料（无活性成分）进样在目标物保留时间无峰；PDA检测器采集各分析物峰前沿、顶点、后沿的UV光谱完全重合，证实峰纯度合格且无共洗脱，方法具足够选择性。
方法绿色度评价（Evaluation of method's eco?friendliness）：Analytical Eco?Scale得分78（满分100，＞75为可接受绿色方法）；GAPI五边形图显示大部分步骤为黄色/绿色，部分橙色提示仍有改进空间；AGREE综合得分0.63（满分1），总体符合绿色分析化学原则。虽非完全无溶剂方法，但较传统HPLC减少了溶剂消耗与废液产生。
讨论与结论翻译：研究人员成功建立并验证了简便、快速、环境较友好的RP?HPLC方法，用于同步定量测定利多卡因与荧光素，适用于原料及复方眼科制剂分析。该方法无需复杂前处理或高端仪器，适合常规质控实验室；总运行时间仅约3分钟，利于高通量检测；按ICH指南全面验证，线性、准确度、精密度、稳健性均符合要求；制剂中聚维酮等辅料不干扰测定；经Eco?Scale、GAPI与AGREE评估具可接受绿色度。综上，所建RP?HPLC方法因快速、可靠、易操作，非常适于眼科溶液中利多卡因与荧光素钠的日常质量控制。
