将计算机辅助的酶设计技术与染色体整合技术相结合，实现了在大肠杆菌（Escherichia coli）中无需质粒辅助地生物合成1,5-戊二醇

《Microbial Cell Factories》：Combining computer-aided enzyme design and chromosomal integration for plasmid-free biosynthesis of 1,5-pentanediol in Escherichia coli

　　

背景：1,5-戊二醇（1,5-PDO）是一种在聚合物、化妆品和制药工业中具有广泛用途的高价值化学品。尽管已构建了多种生物合成途径，但目前重组菌株通常依赖基于质粒的过表达，这需要抗生素且阻碍了工业化规模生产。 结果：研究人员通过CRISPR/Cas9技术将途径基因（davB、davA、gabT、yahK、car、sfp和yqhD）整合到产赖氨酸（lysine）的大肠杆菌菌株染色体中，开发了稳健的无质粒大肠杆菌平台用于从头合成1,5-PDO。羧酸还原酶（carboxylic acid reductase, CAR）筛选鉴定出Nocardia iowensisCAR-Ni最有效，获得的底盘菌株（D13）产生了0.672 g/L 1,5-PDO。综合分析证实，乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase, ADH）介导的5-羟基戊醛（5-hydroxypentanal, 5-HP）还原是一个被低估的瓶颈。随后研究人员筛选了十种内源性ADH，并选择YjgB进行计算机优化。在E205位点进行对接引导的饱和突变（docking-guided saturation mutagenesis）产生了变体YjgB(E205C)，其体外活性提高了3.34倍，减少了5-HP积累，并将滴度提升至0.935 g/L。通过整合pntAB增强NADPH供应进一步将摇瓶滴度提高至1.5 g/L。在5-L补料分批生物反应器中，最终菌株（D91）在不使用抗生素或诱导剂的情况下实现了12.1 g/L的1,5-PDO（得率0.225 mol/mol葡萄糖）。据所知，这是大肠杆菌中报道的最高1,5-PDO滴度。 结论：本研究通过协同代谢工程和计算酶优化建立了可扩展、可持续的生物合成平台。

研究背景与意义

1,5-戊二醇（1,5-PDO）作为一种重要的C5线性二元醇，因其独特的奇数亚甲基结构赋予聚酯等材料优异的柔韧性和热稳定性，在聚合物、化妆品及医药领域具有广泛应用。然而，传统的化学合成法依赖于石油原料，存在高能耗、有毒副产物及环境污染等问题。微生物细胞工厂利用可再生碳源合成1,5-PDO提供了绿色可持续的解决方案。尽管目前已有多种生物合成途径被构建，但现有重组菌株大多依赖质粒携带外源基因，这不仅需要添加抗生素以维持质粒稳定性，增加了生产成本和监管风险，还限制了其在工业规模上的应用。此外，既往研究多集中于优化上游模块（如5-氨基戊酸（5-AVA）和5-羟基戊酸（5-HV）的合成）或羧酸还原酶（CAR）的筛选，而对于下游限速步骤——即5-羟基戊醛（5-HP）还原为1,5-PDO这一环节的研究相对匮乏。5-HP作为一种具有细胞毒性的醛类物质，其积累会抑制细胞生长并限制通量，构成了潜在的“隐藏瓶颈”。因此，开发无质粒的稳定生产系统并针对性地强化下游还原步骤，是推动1,5-PDO工业化生产的关键。该研究发表于《Microbial Cell Factories》，旨在通过结合CRISPR/Cas9介导的染色体整合与计算机辅助酶设计（CAED），构建一个稳定且高效的1,5-PDO生物合成平台。

关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术手段。首先，利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统在产赖氨酸大肠杆菌LE菌株的特定中性位点（如yghX, yjjV等）进行多基因定点整合，构建了无质粒的底盘细胞。其次，通过分子对接模拟（molecular docking simulations）和丙氨酸扫描分析（alanine scanning analysis）对关键酶YjgB进行计算机辅助理性设计，并在E205、D44和W91位点进行了饱和突变文库构建。第三，采用体外竞争实验（in vitro competition assay）在亚化学计量NADPH条件下评估限速步骤，以及外源添加5-HP的毒性实验来验证中间体积累的负面影响。此外，还利用了同源重组、蛋白纯化、高效液相色谱（HPLC）分析及5-L补料分批发酵（fed-batch fermentation）等技术验证表型。

研究结果

1. Construction of the 1,5-PDO biosynthetic pathway in an L-Lysine overproducing E. coli LE strain

研究人员首先在产赖氨酸的大肠杆菌LE菌株中构建了1,5-PDO合成途径。通过将davB、davA、gabT、yahK、car-sfp操纵子和yqhD分别插入yghX、yjjV、ycgH、yeeP、yciQ和yjgX位点，并利用Ptrc启动子驱动。在筛选三种不同来源的羧酸还原酶（CAR-Ma、CAR-Mc、CAR-Ni）后，发现整合了Nocardia iowensisCAR-Ni的菌株D13表现最佳，摇瓶发酵产生0.672 g/L 1,5-PDO和2.45 g/L 5-HP，确立了D13为基础菌株。

2. Systematic identification of 5-HP reduction as the critical bottleneck

为了识别限速步骤，研究人员进行了系统性分析。体外竞争实验显示，在NADPH受限条件下，5-HP的积累速度远快于其转化为1,5-PDO的速度，表明ADH催化的还原步骤是瓶颈。5-HP毒性实验进一步证实，外源添加1.5 g/L 5-HP导致菌体生长显著受抑（OD₆₀₀下降16.5%），说明中间体的积累对宿主代谢具有实质性损害。

3. Screening and computer-aided optimization of alcohol dehydrogenases

针对上述瓶颈，研究人员筛选了10种内源性乙醇脱氢酶（ADH）。体外酶活性测定显示YjgB对5-HP的比活力最高，比参考酶YqhD高出37%。随后，利用Discovery Studio软件进行分子对接和结合能预测，锁定E205、D44和W91三个关键位点进行饱和突变。在构建的57个突变体中，YjgB(E205C)表现出最高的比活力，较野生型提高了3.34倍。将该突变体整合回染色体后，菌株D85的1,5-PDO产量提升至0.935 g/L，同时胞内5-HP积累显著降低。

4. Enhancing NADPH supply via cofactor engineering

鉴于1,5-PDO合成路径对NADPH的高需求（每摩尔产物消耗7摩尔NADPH），研究人员通过整合pntAB操纵子（编码转氢酶）来增强NADPH的再生能力。结果显示，在引入了YjgB(E205C)突变体的背景下，过表达pntAB的菌株D91在摇瓶中产量达到1.5 g/L，且最终OD₆₀₀显著提高，证实了辅因子工程对平衡氧化还原状态和促进产物合成的有效性。

5. Fed-batch fermentation for 1,5-PDO production

在5-L补料分批发酵罐中评估最终工程菌D91的性能。结果表明，D91表现出更快的生长动力学和更高的生物量（OD₆₀₀达21.0）。在96小时发酵结束后，D91实现了12.1 g/L的1,5-PDO滴度和0.225 mol/mol葡萄糖的得率，相比基础菌株D13分别提高了47.2%和60.7%，且全程无需抗生素或诱导剂。遗传稳定性测试显示，经过50代传代培养，菌株的生产性能保持稳定。

结论与讨论

本研究成功建立了一种结合染色体整合与计算机辅助酶设计的协同策略，用于大肠杆菌中1,5-PDO的无质粒从头合成。研究发现并解决了ADH介导的5-HP还原这一长期被忽视的瓶颈问题，通过理性设计获得的高效突变体YjgB(E205C)显著提升了催化效率。辅以pntAB介导的辅因子工程，最终工程菌株在5-L发酵罐中实现了12.1 g/L的1,5-PDO产量，这是目前大肠杆菌宿主中报道的最高滴度。该研究不仅为1,5-PDO的工业化生产提供了一个稳定、可持续且无需抗生素的生物制造平台，也为其他涉及有毒醛类中间体和高NADPH需求的化学品的生物合成提供了通用的工程范式。