《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Porcine-derived amelogenin P148 in a layer-by-layer chitosan/hyaluronic acid coating for enhanced implant osseointegration
编辑推荐：
本研究采用层层组装技术将猪源amelogenin P148修饰于聚多巴胺修饰的钛植入物表面，通过体外细胞实验和体内大鼠实验评估其促进成骨作用。结果显示，P148/CS/HA涂层显著提高细胞增殖、成骨基因表达及ECM合成，激活MAPK-ERK1/2信号通路，并增强体内新骨形成，证实该涂层在骨整合中的临床潜力。
王春宝|陶佩|程玉照|赵鹏宇|曾子瑜|白清云|孔亮|董妍|王中山
江西宜春大学药学院，中国宜春336000
摘要
猪源性釉原蛋白对牙釉质发育至关重要，并在牙周骨再生中具有临床应用价值，但由于其特定异构体的纯化难度较大，限制了对其独特功能的理解和临床转化。在本研究中，我们纯化了猪源性釉原蛋白中最丰富的异构体P148，在多巴胺修饰的钛植入物上构建了壳聚糖/透明质酸（CS/HA）逐层涂层，并利用体外和体内模型初步探讨了其成骨效应及其机制。体外实验表明，P148功能化表面具有优异的生物相容性，显著促进了细胞附着、增殖、成骨基因表达和细胞外基质（ECM）的产生，优于未经修饰的钛表面。此外，这种修饰激活了MAPK-ERK1/2信号通路，这是调控骨髓间充质干细胞（BMSC）分化的关键通路。体内大鼠实验进一步证实了P148/CS/HA涂层能增强植入物周围的新骨形成，凸显了其在改善骨整合方面的潜力。综上所述，这种生物活性表面在临床骨再生领域具有广泛的应用前景。
引言
持续改进牙科钛（Ti）植入物对于满足临床骨整合需求至关重要，尤其是在骨质疏松症或放疗后的颌骨等骨质量受损情况下[1] [2]。与物理和化学方法相比，生物表面修饰通过将特定生物活性分子固定或整合到植入物表面来实现其效果[3] [4] [5]。釉原蛋白是一类对哺乳动物牙釉质生物矿化至关重要的生物蛋白[6]。Emdogain?是一种商业制剂，由猪源性釉原蛋白和丙二醇海藻酸盐（PGA）基质组成，是首个获得FDA批准的用于牙周再生的生物制剂，以其成骨效果而广受认可。因此，将釉原蛋白与钛植入物结合被认为是提高临床疗效的有前景的方法。然而，猪源性釉原蛋白来源于正在发育的牙釉质，由于牙齿胚芽中牙釉质形成阶段的不同，其成分具有异质性[7]。尽管已尝试将其应用于钛植入物以促进骨形成，但结果并不一致，这可能是由于釉原蛋白组成和钛表面处理方法的不同[8] [9]。
这种不一致性的主要原因是天然釉原蛋白混合物的复杂性。釉原蛋白异构体是由釉原蛋白基因的可变剪接或全长蛋白的蛋白水解产生的，占牙釉质基质蛋白（EMPs）的90%以上[10]。这些异构体表现出不同的生物活性，因此需要纯化的单一形式来准确评估其骨整合效应[11]。然而，由于它们复杂的组成、相似的理化性质以及釉原蛋白家族内的强分子间聚集作用，从EMPs中分离特定异构体具有挑战性[12]。
尽管重组技术和合成类似物提高了我们的理解[13] [14] [15]，但天然形式与重组形式之间存在显著的生化和功能差异。因此，人们投入了大量努力来纯化天然釉原蛋白。例如，H.D. Amin将其分为低分子量（LMW，< 6 kDa）和高分子量（HMW，> 6 kDa）组分，发现HMW蛋白具有更强的成骨效应[16]。B.M. Stout也报告称，7–17 kDa组分比原始EMPs混合物更有效地促进了骨形成[17]。尽管这些研究表明HMW釉原蛋白可能产生更好的效果，但由于缺乏纯成分，目前尚无法得出明确结论。
为了解决这一限制，我们的研究团队开发了从EMPs中分离多种天然釉原蛋白异构体的方法[18]。基于先前的研究，我们假设P148（表示猪源性及其148个氨基酸的长度）是EMPs中最丰富的异构体，是一种关键的成骨蛋白。因此，本研究旨在构建一种精确的P148功能化钛植入物，并利用体外和体内模型对其成骨效应及其机制进行初步研究。
逐层（LBL）组装技术能够制造出可作为生物活性化合物持续释放库的功能性涂层。这种方法可以灵活装载多种物质，如小分子药物、核酸和蛋白质，同时保持其生物活性[19] [20]。LBL技术操作简单且成本低廉，通过交替沉积带相反电荷的聚电解质，可以精确控制涂层的组成、厚度和释放行为。这是一种先进的策略，用于将成骨、抗菌和抗炎化合物加载到植入物表面[21] [22] [23]。壳聚糖（CS）是一种线性氨基多糖，因其优异的生物相容性、低免疫原性和抗菌特性而被选中[24] [25] [26]。透明质酸（HA）是一种线性糖胺聚糖，可以容易地与各种生物大分子（包括P148）交联或结合[27] [28] [29]。在本研究中，LBL技术利用了CS和HA之间的静电吸引力，通过交替沉积使钛表面功能化，同时将目标蛋白釉原蛋白P148整合到涂层中[30] [31]。为确保涂层在钛基底上的牢固附着，首先应用了多巴胺（PDA）中间层。PDA中的儿茶酚结构起到了有效的分子桥梁作用，牢固地结合了钛表面和随后的CS层[32]。
本研究旨在在PDA修饰的钛植入物上开发一种由CS和HA组成的LBL自组装涂层，目标是整合天然釉原蛋白异构体P148。通过体外细胞实验和体内动物实验，我们评估了该涂层在增强钛基底成骨潜力方面的效果，并探讨了P148介导的成骨作用的初步机制。这种生物活性涂层代表了改善植入物骨整合的潜在策略。
部分摘录
天然纯釉原蛋白P148的制备
天然猪源性釉原蛋白P148是使用我们之前的研究方法[18]进行纯化的。简要来说，从当地屠宰场收集了六个月大猪的下颌骨。从下颌骨中分离出新鲜的牙齿胚芽。所有涉及样本收集和处理的程序都在第四军医大学口腔医学院伦理委员会的监督下进行。使用
P148的纯化与表征
天然猪源性釉原蛋白P148是使用我们之前的研究方法[18]进行纯化的，随后收集、灭菌并冻干，如图1所示。
EMPs的SDS-PAGE图谱显示在图2A中。凝胶中观察到多个蛋白质条带，表明存在十几种成分。P148和TRAP是两种主要成分，其含量显著高于其他蛋白质。色谱图谱显示在图2B中
讨论
EMPs是由多种釉原蛋白异构体组成的异质混合物，这导致了批次间的变异性，使得难以精确识别单个生物活性成分[39] [40] [41]。在本研究中，我们专注于P148，它是猪源性EMPs中最丰富的天然釉原蛋白异构体，分子量为16918.3 Da。成功纯化P148使我们能够对其生物活性进行明确的研究，而不受其他EMPs的干扰
结论
本研究从EMPs中分离出了天然釉原蛋白异构体P148，并通过LBL组装技术在钛植入物上构建了功能性涂层。P148/CS/HA涂层表现出良好的生物相容性，并通过激活MAPK-ERK1/2信号通路促进了BMSC的成骨活性。体内实验进一步表明，该涂层支持了新骨的形成并增强了植入物周围的骨整合。作为对纯化天然釉原蛋白的早期探索
CRediT作者贡献声明
孔亮：撰写——初稿、验证、方法学、研究、资金获取。白清云：验证、方法学、研究。董妍：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学。王春宝：撰写——初稿、资源、方法学、研究、正式分析、概念化。王中山：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取。曾子瑜：验证，
伦理批准
实验动物程序在第四军医大学口腔医学院伦理委员会的严格监督下进行（批准编号：kq-052）。所有实验方案均遵循ARRIVE指南。所有程序均符合英国《动物科学程序法》（1986年）的规定。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：王中山报告称获得了国家自然科学基金和陕西省重点研发计划的资金支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号81700930）和陕西省重点研发计划（项目编号2024SF-GJHX-07和2024SF-ZDCYL-04–08）的财政支持。作者感谢口腔颌面重建与再生国家重点实验室提供的实验平台。
