《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A high-throughput screening platform for acetylcholinesterase inhibitors using a genetically encoded acetylcholine fluorescent sensor
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本文介绍了一种利用基因编码乙酰胆碱（ACh）荧光传感器（GRAB）构建稳定的共表达细胞系，从而建立高效、低成本乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂高通量筛选（HTS）平台的新方法。该方法无需纯化酶和使用有毒试剂（如Ellman法中的DTNB），成本降低约两个数量级，为神经毒素检测和神经治疗药物发现提供了简化、快速、高通量兼容的工作流程。
基于基因编码传感器的高通量乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选平台
1 引言
乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）是中枢神经系统中的关键水解酶，负责突触间隙中神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine， ACh）的快速降解，从而维持神经元兴奋与抑制之间的平衡。AChE不仅是神经毒剂和有机磷农药的主要作用靶点，其活性异常还与阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease， AD）和重症肌无力等多种神经退行性疾病密切相关。因此，高效、快速地发现和筛选AChE抑制剂对于化学毒素检测、毒理学研究以及神经退行性疾病的药物开发具有迫切且重要的价值。
然而，现有的AChE活性检测方法存在局限性。传统的分光光度法（如Ellman法）虽然简单，但易受样品背景干扰、灵敏度低，且常使用如5，5‘-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）等有毒性试剂。色谱技术（如HPLC、GC/LC-MS）虽然显著提高了精度，但涉及高昂的仪器成本、复杂的样品预处理且耗时，不适合高通量筛选需求。免疫分析法（如酶联免疫吸附测定， ELISA）则受到抗体交叉反应性、热稳定性差和开发成本高等因素的限制。基于纳米材料的新型光电化学传感器等新兴方法虽然通过信号放大策略实现了高灵敏度检测，但仍存在稳定性不足、对专业设备依赖性强等问题。
本研究旨在针对上述方法的不足，开发一种新型的AChE抑制剂筛选方法。该方法利用了新近发展起来的一类基因编码生物传感器——G蛋白偶联受体激活基传感器（GPCR-activation-based sensors， GRAB）。GRAB传感器通过G蛋白偶联受体（GPCR）配体诱导的构象变化，经由分子内环状排列绿色荧光蛋白（circularly permuted green fluorescent protein， cpGFP）转化为荧光信号，实现对包括ACh在内的一系列神经递质的实时、原位检测。本研究基于该原理，提出利用乙酰胆碱GRAB传感器评估AChE抑制活性的新策略。
2 材料与方法
本研究构建了一个稳定共表达ACh探针和AChE的细胞系。首先，将从李实验室获得的pDisplay-Ach3.0质粒中的ACh3.0-IRES-mcherry-CAAX表达盒扩增并插入到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro中，构建了pCDH-ACh-puro质粒。同时，将带有3×Flag标签的AChE基因（Genbank: NM_000665）克隆到GV350慢病毒载体中，构建了Ubc-ACHE-3Flag-SV40-Neomycin质粒。所有构建体均经过DNA测序确认。
通过标准的慢病毒包装流程制备病毒。HEK293T细胞在DMEM培养基中培养。使用磷酸钙法将转移质粒和辅助质粒转染到HEK293T细胞中，48小时后收集病毒。浓缩后的病毒滴度分别达到2 × 108TU/mL（GACh3.0）和1.4 × 109TU/mL（AChE）。
通过嘌呤霉素（puromycin）和G418筛选，获得了稳定共表达GACh3.0和AChE的乙酰胆碱酯酶活性报告细胞（Acetylcholinesterase Activity Reporter Cells， AARC）。采用定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western blotting）和免疫荧光染色等方法对目标基因和蛋白的表达进行了验证。
荧光成像使用Opera Phenix高内涵筛选系统进行。细胞表达的GACh3.0传感器信号通过525/50 nm发射滤光片获取，而mCherry-CAAX信号作为内参通过600/30 nm发射滤光片获取。计算乙酰胆碱（ACh）应用前后绿光（G）与红光（R）荧光强度的比值，并以G/R比值的变化作为荧光响应。
3 结果
3.1 基于GRAB的AChE抑制活性筛选方法设计
本研究设计了一种利用基因编码生物传感器特异性识别ACh的新型、低成本、高通量AChE活性筛选方法。首先，构建了稳定共表达荧光探针和AChE的细胞系。在药物筛选过程中，细胞首先与待测化合物共孵育，随后加入特定浓度的ACh。如果化合物抑制AChE活性，体系中的ACh将诱导荧光探针信号显著上调。反之，如果待测化合物无抑制活性，ACh将被细胞表达的AChE快速水解，导致检测到的荧光信号无显著变化。
3.2 乙酰胆碱GRAB探针在HEK293T细胞中的稳定表达
GACh3.0探针主要由两个模块组成：插入cpGFP的毒蕈碱受体M3R（ACh的天然受体）以及带有CAAX膜定位序列的红色荧光蛋白mCherry。mCherry作为荧光强度的内参，以准确测量绿光变化。qPCR结果显示，慢病毒感染后293T细胞中目标基因的相对定量值相比野生型细胞达到7420.25，表明探针高效表达。共聚焦显微镜结果显示，病毒感染48小时后，绿色和红色荧光蛋白均显著表达，且GACh3.0和mCherry-CAAX在293T细胞中均表现出正确的膜定位。
3.3 AChE在HEK293T细胞中的活性表达
为了在上述细胞中实现AChE的稳定表达，本研究构建了AChE的慢病毒质粒。将稳定表达GACh3.0的GACh-Lenti细胞用制备的慢病毒感染，实现了AChE和GACh3.0的共表达。通过嘌呤霉素和G418筛选获得多克隆稳定细胞系，即AARC细胞。蛋白质印迹和免疫荧光结果证实了AARC细胞中AChE的表达。
为了验证细胞系中表达的AChE是否具有正常的酶活性，用10 μM的毒扁豆碱（physostigmine， AChE抑制剂）或DMSO溶剂预处理AARC细胞5分钟，然后向培养基中加入100 μM乙酰胆碱。观察到，未添加毒扁豆碱的细胞中，乙酰胆碱被快速水解，其荧光强度显著低于DMSO对照组。这一结果表明，细胞中表达的AChE具有强大的水解活性，共表达细胞系的功能符合设计预期。
3.4 筛选系统的优化与测试
在AARC细胞中实现GACh3.0和AChE的稳定活性表达后，本研究基于AARC细胞设计了乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选平台。首先，待测化合物与细胞共孵育5分钟，以确保化合物与靶点充分结合。随后加入乙酰胆碱，检测GACh3.0的激活情况。由于乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶催化下快速水解，在加入乙酰胆碱后短时间内即可观察到荧光信号强度的显著变化。
考虑到AChE对ACh的高水解活性，需要将ACh浓度设定在合适的水平。浓度过低，ACh易被水解，信号检测困难；浓度过高则可能导致假阳性。鉴于GACh3.0探针对ACh响应的EC50在微摩尔水平，本研究测试了六个浓度梯度（10 μM， 50 μM， 100 μM， 200 μM， 400 μM 和 800 μM），并以对GACh3.0无活性的血清素（serotonin）作为对照，评估细胞荧光响应。结果显示，50 μM ACh已足以实现高度显著的差异。考虑到筛选窗口需要更宽以适应不同AChE抑制活性水平的化合物筛选要求，最终选择100 μM ACh作为标准方案。关于信号持续时间，在加入乙酰胆碱后连续监测荧光信号强度7分钟，未观察到明显的信号衰减，这段时间足以完成整个96孔板的扫描。
最终优化的系统完成一批检测（使用96孔或384孔板）所需时间不到10分钟，每个样品的平均检测成本约为0.86元人民币。与现有的商业AChE活性检测试剂盒相比，成本降低了大约两个数量级。
为了进一步验证筛选系统的敏感性，测试了两种AChE抑制剂：新斯的明溴化物（neostigmine bromide， 100 μM）和毒扁豆碱（physostigmine， 10 μM）。以无AChE抑制活性的阿司匹林（aspirin）作为阴性对照。与无活性的阿司匹林和溶剂对照组相比，两种抑制剂化合物均显示出荧光信号的显著差异。在敏感性方面，结果显示毒扁豆碱的EC50值约为8.8 μM，这通常符合化合物高通量筛选的要求。
接下来，通过该筛选方法评估了两种农药（乐果dimethoate和毒死蜱chlorpyrifos）以及一种已批准的阿尔茨海默病治疗药物（盐酸多奈哌齐donepezil hydrochloride）的抑制活性。AARC细胞用这三种化学品（20 μM）预处理5分钟，随后加入100 μM的ACh。结果显示，所有这些化学品都诱导了显著的荧光信号增加，表明本筛选方法适用于不同类型化合物的测试。
4 讨论
鉴于AChE在神经信号传导中的核心作用，它成为多种神经毒剂（如有机磷酸酯和氨基甲酸酯类）的作用靶点。这些毒剂会引起AChE活性的不可逆或可逆抑制，导致突触间隙中大量ACh积聚，从而引发胆碱能危象。另一方面，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的病理进展中，胆碱能神经元功能障碍与认知能力下降密切相关。提高突触ACh水平的策略，特别是使用可逆性AChE抑制剂，已成为缓解症状的一线临床治疗方法。因此，高效、快速地发现和筛选新型、高选择性、低毒性的AChE调节剂（尤其是抑制剂）对于毒理学研究、神经毒剂解毒剂的开发以及神经退行性疾病的药物发现具有紧迫而重要的意义。
近年来，检测AChE活性的新方法不断被探索，按其实验原理大致可分为以下几类：生化比色法、新型纳米探针和计算虚拟筛选。基于Ellman试剂及其荧光变体的比色法仍然应用最广泛，其核心优势在于技术成熟、操作标准化和高通量兼容性好。然而，这些方法通常依赖于提取的酶或组织匀浆，难以在更接近生理环境的活细胞系统中实时反映化合物的作用效果。更重要的是，它们通常需要化学显色剂，其中某些组分可能具有细胞毒性或化学不稳定性。这不仅增加了操作风险和复杂性，还可能干扰某些待测化合物的活性评估。此外，这些方法在通量、成本以及是否适合小型化、自动化高通量筛选平台方面仍有改进空间。相比之下，近年来新兴的纳米传感方法代表了重大的技术进步。通过巧妙的纳米结构设计，它们实现了信号放大，显著提高了检测灵敏度，特别适用于即时检测和高灵敏度分析需求。
然而，无论是传统的比色法还是新型纳米传感器，其基本范式仍然是体外的生化反应。它们通常将AChE视为孤立的生物分子，在预设的缓冲液体系中进行活性测量。尽管虚拟筛选方法可以以前所未有的通量预测化合物与酶活性位点的结合，极大地加速了先导化合物的发现，但其结果最终仍需要通过体外酶学测定来验证。因此，这些方法存在一个共同的局限性：难以反映抑制剂在完整活细胞内的真实药效行为，包括化合物的细胞膜通透性、在细胞内的代谢稳定性以及对细胞内活跃表达的AChE的抑制选择性等。
针对上述挑战，本研究开发并建立了一种基于基因编码生物传感器的AChE活性调节剂新型筛选方法，这本质上是一种在活细胞内进行的功能分析。该方法将编码AChE和ACh探针的基因稳定整合到宿主细胞的基因组中，从而构建了一个可持续、均一化响应的“传感器细胞系”。该方法的优越性主要体现在以下几个方面：首先，它摒弃了传统方法中使用的有毒或不稳定的化学辅助剂。整个检测系统仅需要ACh底物和稳定共表达生物传感器与AChE的细胞。系统简单，生物相容性高，显著降低了潜在的安全隐患和对检测结果的化学干扰。其次，该方法具有显著的成本效益。初步计算表明，其单次检测的试剂成本相比传统的Ellman法可降低约两个数量级，使得大规模筛选项目在经济上高度可行。最后，基于细胞的方法易于适应多孔板形式，操作程序简单，非常适合自动化、高通量的初级药物筛选。它为从海量化合物库中快速发现先导化合物提供了强有力的工具。
值得注意的是，本研究建立的方法还具有很强的可扩展性。一方面，本研究提出的高通量筛选方法主要用于大量候选化合物的第一轮初筛，为提升筛选通量，孵育时间设定为5分钟。研究人员可以对同一群细胞进行长期、连续的数据采集，从而获得精确的抑制剂作用动力学参数，例如起效时间、抑制持续时间和恢复期。这些体外终点法无法获得的时间分辨信息对于评估药物作用持续时间至关重要。另一方面，丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase， BChE）和AChE都是阿尔茨海默病的治疗靶点，且两者都具备水解ACh的能力。遵循本研究开发的原理，可以构建稳定共表达BChE和GACh3.0传感器的细胞系，从而实现对BChE活性调节剂的筛选。考虑到BChE与AChE水解乙酰胆碱的效率不同，所添加的乙酰胆碱浓度和反应时间均需要进一步优化。
总而言之，本研究建立的新型筛选方法以其安全性、低成本、高兼容性和扩展潜力，为AChE调节剂的发现提供了一种有竞争力的替代方案，有望加速相关治疗剂和工具化合物的研发进程。
