《Frontiers in Pharmacology》：Galgeun-tang modulates lipid, glucose, and energy metabolism in diet-induced obesity across cellular, nematode, and murine models
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这篇研究论文（非综述）通过细胞（C2C12肌管）、线虫（C. elegans）和小鼠多层次模型系统评估了传统复方葛根汤（GGT）的抗肥胖作用。结果表明，GGT能剂量依赖性地增强葡萄糖摄取、抑制体重增加、改善胰岛素敏感性、减轻肝脏脂肪变性，并通过下调脂肪生成基因（如FAS， PPARγ）、上调脂肪酸β-氧化标记物（如PPARα， PGC1α）以及调节胰岛素信号通路（如p-AKT/AKT, daf-16/daf-2）等机制，在多靶点上协调调控脂质、葡萄糖和能量代谢，为GGT作为肥胖及相关代谢疾病的潜在多靶点草药干预提供了临床前证据。
1 引言
肥胖已成为全球性的重大健康挑战，是2型糖尿病、心血管疾病和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）等代谢性疾病发病率上升的主要驱动因素。其特征包括脂质储存失调、葡萄糖稳态失衡、胰岛素抵抗和慢性低度炎症。此外，久坐和缺乏体育活动现已被认为是肥胖发生和发展的重要贡献者。尽管目前有多种药物可用，但传统的抗肥胖疗法往往长期疗效有限或伴随不良反应，这凸显了对更安全、多靶点治疗策略的需求。
传统复方因其多效性的生物活性，正日益被探索作为代谢调节的补充方法。葛根汤（Galgeun-tang， GGT）是一种由多种植物药组成的传统韩国复方制剂，包括葛根（Puerariae Radix）、麻黄（Ephedrae Herba）、肉桂（Cinnamomi Ramulus）、芍药（Paeoniae Radix）、甘草（Glycyrrhizae Radix）、生姜（Zingiberis Rhizoma）和大枣（Zizyphi Fructus）。传统上，GGT被用于治疗与普通感冒或流感相关的发热性疾病、炎症性呼吸道疾病以及涉及头、颈和肩部的肌肉骨骼疼痛。
近年来，这些传统适应症促使人们对GGT在代谢性疾病，特别是那些以慢性炎症和能量稳态失调为特征的疾病中的潜在应用产生了日益浓厚的兴趣。实验研究报告显示，GGT能改善高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的脂质谱、调节食欲相关基因表达并改变肠道微生物群组成。此外，GGT中的主要植物来源代谢物也表现出互补的代谢活性。例如，葛根中的主要异黄酮葛根素（puerarin）已被证明可增强胰岛素敏感性、促进脂肪酸氧化并抑制脂肪细胞分化；麻黄及其相关生物碱则被报道可增加产热、抑制食欲并影响肠道微生物组成。这些发现共同表明，GGT可能对脂质、葡萄糖和能量代谢发挥多靶点调节作用。
然而，GGT在不同生物学层次上的系统性及剂量依赖性代谢作用仍未得到充分表征。本研究采用分层实验设计来探究GGT的抗肥胖效应：利用C2C12肌管评估细胞葡萄糖摄取和代谢基因调控；使用HFD诱导的肥胖小鼠在哺乳动物背景下验证全身性代谢结果；同时，引入秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为一种辅助的全生物体模型，以检验在细胞和小鼠模型中观察到的代谢效应在高葡萄糖条件下是否在生物体层面得以保留。
2 材料与方法
2.1 葛根汤（GGT）的制备与高效液相色谱-紫外光谱（HPLC-UV）分析
GGT颗粒购自韩国韩丰制药食品有限公司。该复方由七种植物药组成，均列于韩国药典。所有植物药均经过形态学鉴定和药典标准认证。定量分析了麻黄碱、甘草酸、芍药苷和葛根素等标志性代谢物，作为基于良好生产规范（GMP）生产的提取物的质量控制方法。
2.2 细胞培养与分化
小鼠C2C12成肌细胞在补充有胎牛血清和青霉素-链霉素的培养基中维持培养。为诱导分化，细胞在含有马血清的培养基中培养4-6天，直至≥90%的成肌细胞形成肌管。
2.3 细胞活力测定
C2C12肌管接种于96孔板，并用不同浓度的GGT处理24小时。使用EZ-Cytox测定试剂盒测定细胞活力。
2.4 C2C12肌管葡萄糖摄取测定
使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG测量葡萄糖摄取。分化的C2C12肌管先用低糖培养基孵育，然后用二甲双胍或GGT处理，随后暴露于2-NBDG，通过荧光显微镜观察和微孔板读数器测量荧光强度来评估葡萄糖摄取。
2.5 动物实验
48只雄性C57BL/6J小鼠适应环境后，随机分为六组：正常饮食组、高脂饮食组、二甲双胍组以及GGT低、中、高剂量组。高剂量GGT根据人体临床剂量通过体表面积归一化换算确定。所有小鼠在初始2周预处理期饲喂普通饲料以稳定药物暴露，随后进行为期8周的饮食干预期。在此期间，正常饮食组饲喂正常饲料，而高脂饮食组和治疗组则饲喂高脂饲料并补充10%果糖的饮用水，以加剧胰岛素抵抗和代谢功能障碍。每周记录体重，每周两次测量食物摄入量。
2.6 口服葡萄糖耐量试验
小鼠禁食16小时后，通过口服灌胃给予葡萄糖溶液。在0、30、60、90和120分钟时从尾静脉测量血糖水平，并计算曲线下面积。
2.7 血清生化分析
使用商业检测试剂盒比色法测量血清总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和高密度脂蛋白胆固醇水平。通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清胰岛素和糖化血红蛋白。
2.8 组织学分析
取小鼠肝脏和附睾脂肪组织样本，固定、石蜡包埋并切片。切片进行苏木精-伊红染色，使用光学显微镜获取图像。使用ImageJ软件量化附睾脂肪组织切片中的脂肪细胞大小。
2.9 蛋白质提取与Western印迹分析
取肝组织匀浆，离心收集上清液。测定总蛋白浓度后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转印至膜上。膜经封闭后，与针对磷酸化AKT、总AKT、磷酸化AMPK和总AMPK的一抗孵育，随后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。使用增强化学发光试剂检测免疫反应蛋白条带，并通过成像系统捕获。使用ImageJ软件进行光密度分析，将磷酸化蛋白水平归一化至相应的总蛋白水平以评估通路激活。
2.10 线虫培养与处理
使用野生型N2品系秀丽隐杆线虫和大肠杆菌OP50，在20°C下于线虫生长培养基上维持培养。通过将N2线虫暴露于补充2%葡萄糖的NGM培养基建立高糖饮食模型。通过次氯酸盐处理实现年龄同步化。实验组包括无葡萄糖的正常对照组、高糖组、以及补充有不同浓度GGT或二甲双胍的高糖处理组。同步化的L1期线虫在含有相应化合物的培养基中生长至L4期以评估体型。
2.11 线虫寿命测定
同步化后，L4期线虫在含有氟尿苷的NGM平板上培养3天。然后将50条L4期线虫转移至含有相应化合物的平板上，每48小时计数死亡线虫数量。存活线虫每2天转移至新鲜NGM平板。通过轻柔铂金丝探针探测无反应判定为死亡。通过生成Kaplan-Meier曲线分析生存数据。
2.12 线虫脂质染色与定量
使用油红O和尼罗红染色方法。L4期线虫收集、洗涤并固定，随后用配置好的染色液染色。染色后，线虫洗涤以去除多余染料。对于油红O染色，线虫置于显微镜载玻片上观察；对于尼罗红染色，使用荧光显微镜观察。所有图像使用相同的显微镜设置捕获。使用ImageJ通过测量平均像素强度（背景扣除后）来量化染色强度。使用PicoSens?甘油三酯测定试剂盒测量甘油三酯水平。
2.13 线虫葡萄糖摄取测定
同步化后，L4期或成年期线虫收集并在含有2-脱氧葡萄糖的M9缓冲液中孵育。使用商业检测试剂盒评估葡萄糖摄取，测量吸光度。
2.14 定量实时PCR
使用TRIzol试剂提取总RNA。使用SYBR Green实时PCR预混试剂在LightCycler 96平台上进行qPCR分析。采用2?ΔΔCT方法计算相对基因表达量。
2.15 统计学分析
数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验以评估处理效果。使用GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析，显著性水平设为p < 0.05。
3 结果
3.1 GGT对C2C12肌管葡萄糖摄取和基因表达的影响
细胞活力分析显示，与阴性对照组相比，0.4、0.6和0.8 mg/mL GGT未引起细胞活力显著差异，但1、1.5和2 mg/mL GGT组显示出细胞活力显著降低。在分化的肌管中，GGT组和二甲双胍组均显著增强了葡萄糖摄取。qPCR分析显示，二甲双胍组和GGT组均显著上调了GLUT4、GK、Tfam、CPT1α和PGC1α的表达，而NRF表达仅被二甲双胍显著增加 。
3.2 GGT补充对HFD诱导的肥胖小鼠的影响
3.2.1 体重与食物摄入
为期8周的HFD喂养增加了体重增长。二甲双胍组体重增长减少最显著，所有三个GGT处理组均显著抑制了体重增长。食物摄入量监测显示，各组间无统计学显著差异，但正常饮食组在3-7周的食物摄入量最低，而在第2周和第8周，GGT高剂量组的食物摄入量在所有组中最低 。
3.2.2 葡萄糖耐量与空腹血糖
口服葡萄糖耐量试验测量显示，二甲双胍和GGT补充改善了葡萄糖耐量，GGT高剂量组在30至120分钟间的数值与正常饮食组相当。口服葡萄糖耐量试验曲线下面积在二甲双胍、GGT中剂量和高剂量组显著降低。与高脂饮食组相比，所有治疗组的空腹血糖水平均显著降低 。
3.2.3 器官重量与组织学分析
测量了肝脏、总脂肪、附睾脂肪、肠系膜脂肪和皮下脂肪的重量。HFD喂养增加了肝脏和脂肪组织重量。二甲双胍和所有GGT剂量均显著降低了肝脏、总脂肪和各脂肪库的重量，其中GGT高剂量组对总脂肪和肠系膜脂肪的减少效果最大。组织学检查显示，HFD喂养小鼠存在广泛的肝脏和脂肪脂质积累，而二甲双胍、GGT中剂量和高剂量组则显著减轻了这种积累 。
3.2.4 血清生化参数
与高脂饮食组相比，二甲双胍组和GGT高剂量组的血清甘油三酯和总胆固醇水平显著降低。此外，所有治疗组的高密度脂蛋白胆固醇水平均显著增加，其中GGT高剂量组差异最显著。在肝功能方面，二甲双胍组和GGT组的谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平均显著低于高脂饮食组。在糖代谢方面，二甲双胍组和所有三个GGT补充组的血清胰岛素和糖化血红蛋白水平均显著低于高脂饮食组，表明血糖调节得到改善 。
3.2.5 肝脏和脂肪组织基因表达
在肝脏中，二甲双胍和所有GGT组均下调了脂肪生成相关基因的表达，并上调了β-氧化标志物的表达。糖异生基因被抑制，其中GGT高剂量组效果最显著。促炎细胞因子表达显著降低，特别是所有GGT组的IL-6。在脂肪组织中，二甲双胍和GGT高剂量组显著抑制了PPARγ、SREBP1c、ACC1和LPL的表达。GGT低、中、高剂量组的PPARα表达水平高于高脂饮食组，但差异无统计学意义。相反，GGT中剂量和高剂量组与高脂饮食组相比，PGC1α表达显著上调。
3.2.6 肝脏蛋白表达
通过Western印迹分析检测肝脏AKT和AMPK信号通路。当磷酸化蛋白水平归一化至相应的总蛋白水平时，与高脂饮食组相比，GGT低剂量组的p-AKT/AKT比率显著增加，表明低剂量GGT增强了AKT活化。在GGT中剂量或高剂量组中，未观察到p-AKT/AKT比率相对于高脂饮食组有统计学显著变化。对于AMPK信号，实验组间p-AMPK/AMPK比率未检测到统计学显著差异。
3.3 GGT在线虫中的影响
3.3.1 生长与寿命
在高糖饮食模型中，与正常对照组相比，线虫体长和体宽均增加，而二甲双胍和所有GGT剂量均显著降低了这两个参数。生存分析显示，二甲双胍组和GGT处理组的寿命得到改善，其中GGT 0.5 mg/mL组存活率最高 。
3.3.2 脂质积累与葡萄糖摄取
通过油红O和尼罗红染色、甘油三酯定量和葡萄糖摄取测定评估了GGT对高糖饮食诱导线虫脂质积累和葡萄糖摄取的影响。油红O和尼罗红染色显示，高糖饮食诱导的脂质积累被二甲双胍和所有GGT处理减少。甘油三酯水平和葡萄糖摄取也降低，表明代谢调节得到改善 。
3.3.3 基因表达
评估了GGT对暴露于高糖饮食的线虫中脂质代谢和胰岛素信号相关基因表达的影响。在高糖饮食条件下，多个脂肪生成相关基因的表达显著增加。二甲双胍和GGT部分减弱了这些基因的表达，但反应程度因剂量而异。对于脂肪分解相关基因，在高糖条件下观察到不同的表达模式。对于脂肪酸β-氧化相关基因，在高糖饮食条件下表达水平普遍高于正常对照组。在胰岛素/IGF-1信号通路中，高糖饮食组的daf-16表达降低，daf-2表达增加。与高糖饮食组相比，二甲双胍、GGT 0.5 mg/mL和GGT 2.0 mg/mL处理显著增加了daf-16表达，而daf-2表达则被二甲双胍、GGT 0.5 mg/mL和GGT 1.0 mg/mL显著降低。
4 讨论
本研究证明，葛根汤通过协调调节脂质、葡萄糖和能量代谢，在细胞、生物体和全身性实验模型中发挥抗肥胖作用。采用分层实验设计是为了捕捉单一模型无法完全解决的代谢调节互补方面。
GGT在不同模型中一致地抑制脂肪生成并促进脂肪分解。在HFD诱导的肥胖小鼠中，肝脏和脂肪脂质积累显著减少，血清脂质谱改善，组织学脂肪变性减轻。这些变化伴随着脂肪生成相关基因的下调和β-氧化标志物的上调。在线虫中，GGT补充抑制了脂质积累，并显著降低了甘油三酯水平。基因表达分析显示脂肪生成相关基因一致下调，而与脂肪分解和脂肪酸β-氧化相关的基因则表现出混合模式。本研究观察到的降脂作用得到了先前关于GGT主要代谢物抗脂肪生成和代谢调节特性的报告支持。
GGT补充还增强了能量代谢和线粒体活性。在C2C12肌管中，GGT增加了线粒体生物合成标志物和脂肪酸转运相关基因的表达，表明氧化能力增强。在HFD喂养的小鼠中，GGT减少了体重增长，并增加了肝脏PPARα和PGC1α的表达，提示β-氧化通路被激活。
葡萄糖稳态在不同模型中均得到持续改善。在C2C12肌管中，GGT增强了葡萄糖摄取并上调了GLUT4和葡萄糖激酶的表达。在HFD喂养的小鼠中，空腹血糖、胰岛素、糖化血红蛋白和口服葡萄糖耐量试验反应因GGT处理而显著改善，并伴有糖异生基因表达的抑制。肝脏AKT磷酸化在低剂量GGT时显著增强，而较高剂量未引起统计学显著增加，表明对胰岛素信号存在剂量和背景依赖性调节。在线虫中，GGT与胰岛素信号相关基因（包括daf-2和daf-16）的表达改变相关，支持了在不同模型中观察到的生物体层面代谢效应。
从临床角度来看，本研究的意义在于探索GGT作为肥胖和代谢功能障碍的多靶点治疗选择。尽管胰高血糖素样肽-1受体激动剂和双重GLP-1/GIP受体激动剂在减肥方面显示出显著疗效，但其临床使用仍存在争议。在此背景下，像GGT这样的传统多组分复方提供了一种具有独特作用机制的补充方法。GGT在本研究中展示了跨多个生物学层次对脂质代谢、葡萄糖稳态、胰岛素信号和能量消耗的协调调节。这种多通路调节可能在提供代谢益处的同时，潜在地降低与单靶点药物疗法相关的严重不良反应风险。
5 结论
总之，GGT通过在细胞、生物体和哺乳动物模型中调节脂质代谢、葡萄糖稳态、胰岛素信号和能量消耗，发挥多靶点抗肥胖作用。本研究使用分层实验方法证明，GGT抑制脂肪生成、增强脂肪酸氧化、改善胰岛素敏感性并促进线粒体活性，同时表现出多组分复方特有的剂量和背景依赖性调节模式。从C2C12肌管和HFD诱导的肥胖小鼠获得的互补结果为GGT的代谢作用提供了机制见解，而线虫数据则提供了辅助的生物体层面证据。尽管需要进一步研究以明确组织特异性机制、最佳剂量、长期疗效和临床安全性，但本研究结果为支持GGT作为肥胖和代谢功能障碍管理的辅助或替代策略的潜在应用提供了坚实的临床前理论基础。
