《Frontiers in Oncology》：Brusatol inhibits metastasis of triple-negative breast cancer through metabolic reprogramming
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三阴性乳腺癌（TNBC）侵袭性强、易转移且预后不良。天然化合物Brusatol（BRU）已报道具有抗肿瘤活性，但其对肿瘤转移及代谢的影响尚未明确。本研究聚焦于细胞外基质（ECM）脱离状态下的TNBC细胞，揭示BRU可通过靶向磷酸戊糖途径（PPP）、糖酵解及三羧酸（TCA）循环等代谢通路，引发代谢重编程，导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）耗竭与氧化还原（Redox）失衡，从而抑制肿瘤细胞在体内的转移性定植，为TNBC辅助治疗提供了新视角。
文章内容归纳总结
1 Introduction
乳腺癌是全球女性中发病率最高、癌症相关死亡率最高的恶性肿瘤。其中，三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的亚型，占所有乳腺癌的15%–20%，其特点是远处转移风险高。TNBC的转移过程包括肿瘤细胞从细胞外基质（ECM）脱离、局部侵袭与迁移、进入血管或淋巴管、在循环中存活以及在远处部位最终形成继发性肿瘤等多个步骤。失去与ECM及邻近细胞的附着会触发一种称为失巢凋亡的程序性细胞死亡。为了在血流中存活并在远处器官建立转移灶，肿瘤细胞必须发展出对失巢凋亡的抵抗能力，从而实现锚定非依赖性生长。除了失巢凋亡抵抗，ECM脱离还会诱导一系列非失巢凋亡相关的变化，例如营养摄取改变、代谢重编程、线粒体自噬诱导以及信号转导通路的重新排列。这些变化会损害细胞活力甚至导致细胞死亡。由于TNBC细胞在肿瘤进展和转移过程中经常遭遇ECM脱离，因此，清除ECM脱离的细胞对于提高晚期TNBC患者的生存率至关重要。
肿瘤代谢重编程是指癌细胞为应对环境或病理条件而发生的代谢途径适应性改变，有助于满足合成代谢生长需求和推动肿瘤发展。例如，ECM附着的肿瘤细胞即使在常氧条件下也优先利用糖酵解作为其主要葡萄糖代谢途径，以快速产生能量供肿瘤生长。相比之下，ECM脱离的TNBC细胞表现出葡萄糖摄取减少和活性氧（ROS）水平升高。在这些条件下，磷酸戊糖途径（PPP）可能取代糖酵解成为主导途径，生成NADPH以维持氧化还原稳态，这使得ECM脱离的TNBC细胞能够逃逸死亡。因此，靶向代谢重编程代表了癌症治疗一个有前景的治疗途径。
近年来，天然产物因其易得、低成本、毒性小、副作用有限、产生耐药性的可能性较低且疗效较高，作为癌症治疗的有望药物而受到关注。鸦胆子油是从鸦胆子种子中提取的，已用于治疗多种疾病，包括癌症、阿米巴痢疾和疟疾。Brusatol（BRU）是从鸦胆子油中纯化的一种均内酯化合物，是油的主要活性成分，已显示出显著的抗癌活性。研究表明，BRU的抗癌作用包括促进转录因子Nrf2的降解、抑制下游抗氧化基因表达、诱导细胞凋亡，以及抑制肿瘤细胞增殖、上皮-间质转化（EMT）和侵袭。先前的研究报道，低剂量BRU和虎杖苷联合治疗能显著抑制TNBC细胞的生长，同时将毒副作用降至最低。此外，BRU已被证明能逆转多种肿瘤细胞的化疗耐药性，使其对化疗药物敏感，并增强化疗效果，包括与紫杉醇联合治疗TNBC。然而，大多数关于BRU的研究都是在ECM附着的细胞上进行的，关于其对肿瘤代谢和远处转移影响的研究有限。
本研究表明，BRU通过诱导深刻的代谢重编程来抑制TNBC转移。从机制上讲，BRU在体外下调了PPP通量，减少了NADPH的产生，并促进了ECM脱离的TNBC细胞的死亡。在体内，BRU显著抑制了ECM脱离肿瘤细胞的定植，并抑制了其在小鼠模型中的生长。这些发现为BRU的治疗潜力提供了新的见解，并为TNBC的治疗提出了新方向。
2 Materials and methods
本研究使用的试剂包括从MedChemExpress购买的纯度99.89%的Brusatol（HY-19543），以及多种细胞培养、检测试剂和抗体。实验使用了人乳腺癌MDA-MB-231细胞和BT-549细胞。为模拟ECM脱离状态，使用聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被培养板。
研究方法涵盖多个方面：
- 1.
细胞培养与处理：细胞在含10%胎牛血清的DMEM中培养。对于基质脱离培养，用poly-HEMA溶液包被培养板。
- 2.
蛋白质免疫印迹（Western blot）：检测目标蛋白（如G6PD）的表达水平。
- 3.
全局代谢组学分析：由麦特维创科技有限公司进行。通过高效液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术，分析细胞代谢物。代谢物含量通过标准曲线计算，并使用Z-score转换进行归一化，通过热图可视化。
- 4.
NADP+/NADPH水平及比率测定：使用商业试剂盒，通过测量450 nm处吸光度，计算NADP+和NADPH含量。
- 5.
活性氧（ROS）测量：使用探针DCFH-DA，通过流式细胞术检测细胞内ROS水平。
- 6.
实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：检测PPP和糖酵解途径相关关键酶（如HK2、G6PD、TKT、6PGD、PFKFB、GAPDH等）的mRNA表达水平。
- 7.
细胞死亡检测：采用台盼蓝染色法计算细胞死亡率。
- 8.
乳酸脱氢酶（LDH）测定：评估细胞毒性。
- 9.
肿瘤球体培养：在特殊培养板中形成3D肿瘤球体，观察形态并检测细胞活力。
- 10.
小鼠异种移植模型：通过尾静脉注射表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞构建肺转移模型。小鼠随机分为两组，分别腹腔注射含1% DMSO的PBS或BRU（2 mg/kg），以5天为周期治疗6个周期。通过活体成像系统（IVIS）在不同时间点进行生物发光成像，实验终点处死小鼠，取肺进行离体成像和组织学（H&E染色）分析。
- 11.
统计分析：数据以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism软件进行统计检验。
3 Result
3.1 Brusatol promotes ECM-detached cell death in TNBC cells
Brusatol（BRU）已被证明能抑制ECM附着条件下癌细胞的增殖。本研究使用poly-HEMA包被板模拟ECM脱离。LDH释放实验和台盼蓝染色均显示，与ECM附着细胞相比，MDA-MB-231脱离细胞的LDH释放和细胞死亡增加。值得注意的是，BRU处理以浓度依赖性方式进一步增强了基质脱离细胞的细胞外LDH活性。台盼蓝染色显示，BRU显著增加了ECM脱离细胞的死亡率，但在ECM附着条件下与DMSO处理组无明显差异。此外，DMSO处理本身在ECM脱离条件下也导致比附着条件下更高的细胞死亡，这表明细胞在基质脱离后具有固有的脆弱性。
为深入研究BRU的影响，我们检查了肿瘤球体的形态特征并评估了3D肿瘤培养中的细胞活力。在前3天，BRU处理的球体比对照组大，表明细胞间未能形成适当的连接。随后，BRU处理抑制了肿瘤球体的生长。到第6天，BRU处理球体的细胞活力比对照组降低了40-50%。总之，这些结果表明BRU在ECM脱离条件下促进了TNBC细胞的死亡并抑制其增殖。
3.2 Brusatol inhibits TNBC metastasis
鉴于BRU能促进悬浮TNBC细胞的死亡，我们进一步评估了其体内抗转移效果。通过尾静脉注射表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞构建小鼠肺转移模型。注射后，小鼠随机分为两组，在整个研究期间腹腔注射DMSO或BRU（2 mg/kg）共六次。使用IVIS系统每10天进行一次异种移植物的生物发光成像。在第1天，对照组的生物发光信号比BRU处理组高12倍。到第10天，这种差异减小，对照组信号高2倍，表明BRU延迟了ECM脱离细胞在肺部的定植。到第20天和第30天，BRU处理显著抑制了肺部定植肿瘤的生长。
接下来，我们取出小鼠肺脏进行离体生物发光实验。定量分析显示，与对照组相比，BRU处理组的发光信号减少了80%。重要的是，在治疗期间，BRU处理的小鼠体重没有显著下降，表明在本研究范围内BRU耐受性良好。此外，肺组织学分析显示，对照组形成了许多大的转移性病灶，而BRU处理组的转移灶数量显著减少且体积更小。后期时间点生物发光信号的持续抑制以及肺结节数量和面积的减少表明，BRU不仅减少了循环肿瘤细胞的初始负荷，还阻碍了ECM脱离细胞在肺部的定植。总之，这些发现证明BRU在体内有效抑制了TNBC转移。
3.3 Brusatol induces metabolic reprogramming, particularly through the PPP
为研究BRU影响的代谢途径，对悬浮培养的MDA-MB-231细胞进行了基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的代谢组学分析。已知ECM脱离会导致葡萄糖摄取大幅减少，而BRU处理进一步加剧了这种减少。值得注意的是，代谢组学分析显示，BRU处理后，PPP（变化最明显）、糖酵解和三羧酸（TCA）循环的中间代谢物水平显著下降，包括D-葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸、D-木酮糖-5-磷酸和3-磷酸甘油酸。
有趣的是，BRU处理导致了D-赤藓糖-4-磷酸和乳酸的积累。同时，BRU处理后细胞内乙酰辅酶A水平降低，表明脂肪酸氧化也受到抑制。尽管作为核苷酸前体的核糖-5-磷酸减少，但流向核苷酸合成的代谢通量却升高，这可能是代偿性重编程的结果。此外，氨基酸水平，特别是谷氨酰胺，显著增加。谷氨酰胺代谢为氨基酸和核苷酸生物合成提供氮源，并作为碳源补充TCA循环，增强了TNBC细胞的耐受性。总之，这些发现表明，BRU在ECM脱离时广泛影响代谢重编程，特别是通过抑制PPP。
鉴于代谢物水平的降低可能与PPP和糖酵解中的酶有关，我们使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）进一步评估了这些途径中关键酶的mRNA表达。正如预期，与ECM附着细胞相比，ECM脱离的MDA-MB-231细胞表现出大多数酶的mRNA水平更高。BRU处理仅引起ECM附着细胞mRNA水平的微小变化。值得注意的是，在ECM附着细胞中，BRU下调了几种糖酵解相关酶，而在ECM脱离细胞中，这种抑制作用更全面且更明显。有趣的是，除HK2外，PPP相关酶的mRNA水平在BRU刺激下普遍升高。总之，BRU在代谢压力下广泛抑制了ECM脱离细胞的糖酵解能力，损害了其满足基本能量和生存需求的能力，从而促进了BRU诱导的ECM脱离细胞死亡。
3.4 Brusatol impairs redox homeostasis through NADPH depletion
为阐明BRU影响ECM脱离细胞中PPP的机制，我们接下来评估了其对NADPH水平和NADPH/NADP+比率的影响。正如预期，DMSO处理的ECM脱离MDA-MB-231细胞与附着细胞相比，表现出显著升高的NADPH水平和NADPH/NADP+比率。BRU特异性地逆转了ECM脱离细胞中的这种适应，显著降低了NADPH水平和NADPH/NADP+比率，而对附着细胞影响甚微。BRU诱导的这种主要细胞还原剂的耗竭促使我们评估功能性氧化还原状态。我们使用DCFH-DA进行流式细胞术测量ROS水平，结果显示BRU处理特异性地触发了MDA-MB-231细胞和BT-549细胞的ECM脱离细胞内ROS水平的显著增加，而在ECM附着细胞中无明显变化。这些数据直接将PPP抑制和NADPH耗竭与靶细胞中的氧化还原应激联系起来。这些发现表明BRU加剧了ECM脱离TNBC细胞的氧化还原应激，从而促进细胞死亡并抑制转移。
作为PPP中的限速酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）从NADP+再生NADPH，并通过短期和长期机制调节氧化应激。先前研究表明，Nrf2在ECM脱离条件下通过下调TAP73促进G6PD表达。然而，在我们的研究中，Nrf2抑制剂BRU并未降低G6PD的mRNA水平。因此，我们评估了ECM附着和脱离条件下的G6PD蛋白水平。蛋白质免疫印迹分析和光密度定量表明，在MDA-MB-231和BT-549细胞中，无论是附着还是脱离条件，BRU处理后G6PD蛋白水平均下降。值得注意的是，在ECM脱离细胞中，特别是在100 nM浓度下，观察到G6PD蛋白的下降趋势。这表明BRU对PPP活性和NADPH生成的抑制可能部分归因于G6PD表达的减少。总之，这些发现证明BRU通过抑制PPP和耗竭NADPH，破坏了ECM脱离TNBC细胞的氧化还原稳态，导致致命的氧化应激。虽然在脱离细胞中较高浓度的BRU导致G6PD蛋白减少，但同时G6PD mRNA的上调表明转录抑制并非PPP抑制的唯一驱动因素。因此，该机制可能涉及对G6PD蛋白丰度的部分限制以及对其酶活性的直接或翻译后抑制的结合，而非纯粹的基于表达的PPP抑制。
4 Discussion
过去几十年，中药和天然化合物因其低成本、毒性小、能够逆转耐药性以及有前景的抗肿瘤功效，在癌症治疗中受到广泛关注。白藜芦醇、莪术醇、人参皂苷和BRU等草本提取物已在多种癌症治疗中显示出显著的抗肿瘤和抗转移作用。然而，大多数研究都集中在EMT、肿瘤细胞侵袭和迁移上。在本研究中，我们研究了BRU在ECM脱离条件下（转移过程中的持续状态）的抗肿瘤作用。我们的研究结果表明，BRU显著促进悬浮细胞的死亡，延迟循环肿瘤细胞的定植并抑制TNBC转移。正如我们的体外发现所支持，后期时间点持续且增强的抑制，以及肺结节数量和面积的减少，表明BRU也损害了早期建立的微转移灶的存活或渐进性生长。这表明BRU靶向的PPP依赖性所赋予的代谢脆弱性可能在肿瘤细胞定植的初始阶段持续存在。值得注意的是，我们探索了BRU对肿瘤细胞代谢的影响，通过靶向代谢为BRU在肿瘤转移中的应用提供了依据。
活性氧（ROS）是有氧代谢的副产物，在信号转导和蛋白质调节等生理过程中发挥重要作用。然而，过量的ROS水平会损伤DNA、脂质、蛋白质甚至细胞器，最终导致细胞死亡。越来越多的证据表明，由于内在和外在因素（如缺氧、过氧化物酶体功能障碍和锚定非依赖性生长），肿瘤细胞会产生过量的ROS。在原发部位的快速增殖过程中，尤其是在转移过程中，ECM脱离的肿瘤细胞依赖多种防御系统将ROS水平维持在致死阈值以下。这些系统包括谷胱甘肽和过氧化还原蛋白途径，其中NADPH是通用的还原当量。基于这些见解，我们推测BRU通过抑制NADPH生成、损害抗氧化防御和升高ROS水平来促进EMC脱离的TNBC细胞死亡。
Nrf2是氧化应激反应的主要调节因子，可激活多种抗氧化和解毒基因的表达，包括G6PD、IDH1/IDH2。研究表明，Nrf2抑制可通过下调糖酵解相关基因（如GLUT1、HK2、LDHA和PDK1）来抑制糖酵解。在急性髓系白血病（AML）中，已有报道称BRU通过抑制糖酵解和G6PD引发抗AML效应。同样，张等人证明在乳腺癌细胞中抑制Nrf2可降低G6PD表达，抑制PPP，并抑制肿瘤增殖和迁移。相比之下，我们的研究发现，在ECM脱离条件下BRU处理并未降低G6PD的mRNA水平，但降低了其蛋白水平，这表明G6PD的调控可能涉及替代途径。因此，我们假设BRU在ECM脱离TNBC细胞中对PPP的抑制主要依赖于葡萄糖摄取的减少。
尽管靶向改变的肿瘤代谢是癌症治疗的一种新兴策略，但其在过去十年的治疗进展有限。例如，2-脱氧葡萄糖（2-DG）是一种葡萄糖类似物和糖酵解中己糖激酶2（HK2）的竞争性抑制剂，可阻止葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸（G6P），导致ATP耗竭和细胞死亡。虽然2-DG在临床前研究中显示出有希望的结果，并进入治疗实体瘤和激素难治性前列腺癌的I/II期临床试验，但由于其抑制肿瘤生长的疗效有限且毒性显著，最终开发被中止。这些挑战突显了需要更有效靶向肿瘤代谢的新型药物。
在我们的研究中，发现BRU能显著抑制ECM脱离TNBC细胞中PPP、糖酵解和TCA循环的通量，同时诱导谷氨酰胺代谢和ATP水平的代偿性增加。这一观察结果与先前的研究一致，即单独靶向葡萄糖代谢会驱动肿瘤细胞越来越依赖谷氨酰胺分解来生存。这种代谢可塑性是由癌细胞固有的遗传和表观遗传不稳定性驱动的，这使它们能够快速适应代谢压力。尽管BRU抑制了PPP、糖酵解和TCA循环，但ECM脱离TNBC细胞的死亡程度对于癌症治疗而言仍然不足。最近的研究表明，同时使用CB-839阻断谷氨酰胺代谢和使用3-BP抑制糖酵解能有效减少肿瘤病灶，而单独使用任一种药物则不能。基于这些发现，我们提出将BRU与谷氨酰胺分解抑制剂联合使用，可能会增强其靶向TNBC代谢的治疗效果。这种联合策略可能有助于克服肿瘤细胞的代谢适应性并改善治疗结果。
需要指出的是，本研究存在一定的局限性。体内转移实验采用的样本量较小（每组n=3）。虽然在我们的初步研究中观察到BRU显著的抗转移效应，但未来需要更大规模的动物队列研究，以进一步探索BRU在转移性TNBC中的治疗窗口和潜在联合策略。本研究的一个局限性是，肺转移灶是基于H&E染色切片中的组织学形态进行定量的。尽管实验模型强烈支持这些病灶来源于人类肿瘤，但未来使用人类特异性标志物的免疫组织化学研究可以提供更精确的定量。
总之，本研究证明BRU通过改变代谢重编程来抑制TNBC转移，包括抑制糖酵解、PPP和TCA循环。这些发现突出了BRU作为靶向代谢疗法有前景药物的潜力，并表明其与谷氨酰胺分解抑制剂联合使用可能会进一步提高治疗效果。
5 Conclusions
在我们的研究中，我们证明天然化合物Brusatol（BRU）通过限制葡萄糖-6-磷酸（G6P），导致依赖磷酸戊糖途径（PPP）的脱离细胞陷入底物饥饿。尽管细胞试图通过上调关键PPP酶（如G6PD和6PGD）的表达来补偿，但这种反应最终失败，导致NADPH耗竭、活性氧（ROS）积累和不可逆的氧化应激。这些发现表明，BRU通过代谢重编程、耗竭NADPH，从而破坏氧化还原稳态，诱导ECM脱离TNBC细胞死亡，并抑制其转移潜力。因此，我们的研究表明BRU是转移性乳腺癌一种有前景的治疗药物，同时也为对抗转移性乳腺癌的治疗提供了新的机制见解。
