水稻反义天然转录本NAT1850调控pri-miR1850介导的低温耐受性平衡机制

《Plant Biotechnology Journal》：The Rice Cis-Natural Antisense Transcript NAT1850 of Pri-miR1850 Negatively Regulates Cold Tolerance by Repressing NPR3

本研究聚焦水稻反义天然转录本（cis-NATs）的功能，发现NAT1850通过形成双链RNA与pri-miR1850相互作用，产生小干扰RNA siR1850，共同负向调控低温耐受性。关键机制在于siR1850与miR1850.1均靶向并抑制NPR3基因，而NPR3作为转录共激活因子与WRKY76协同激活DREB1B以响应冷胁迫。有趣的是，NAT1850-siR1850模块还通过独立于miR1850.1-NPR3的通路调控氮同化和产量，揭示了pri-miRNA与其cis-NAT在平衡抗逆与生长中的新调控模式。

　　

1. 引言

非编码RNA（ncRNAs）在植物发育、免疫和胁迫响应中扮演重要角色，其中反义天然转录本（NATs）广泛存在于植物基因组，但功能大多未知。本研究旨在解析水稻中一个与冷响应miRNA（miR1850）位点完全重叠的cis-NAT（NAT1850）的调控功能及其在冷胁迫下的作用机制。

2. 结果

2.1 NAT1850是水稻Pri-miR1850的反义天然转录本

基于数据库分析和RACE测序，研究者鉴定到一个与水稻特有初级miRNA pri-miR1850完全序列重叠的转录本Os05g0528701，并将其命名为NAT1850。该转录本不编码蛋白质，被证实为cis-天然反义长链非编码RNA（cis-lncNAT）。表达分析显示，pri-miR1850的转录水平高于NAT1850，但两者在幼苗不同发育阶段和不同组织器官中的表达模式相似，均在根部和开花后5天的种子中表达较高。

2.2 Pri-miR1850与NAT1850之间的相互调控

研究发现，pri-miR1850能促进NAT1850的积累，而成熟的miR1850.1和miR1850.2则不能。双荧光素酶报告实验证实，pri-miR1850能增强NAT1850启动子活性。另一方面，过表达NAT1850会降低pri-miR1850转录本及其成熟产物miR1850.1和miR1850.2的水平。瞬时共表达实验表明，NAT1850直接抑制pri-miR1850，但并不作为内源性靶标模拟物（target mimic）来抑制成熟的miR1850s。

2.3 源于Pri-miR1850转录本的21 nt siRNA（siR1850）的形成

pri-miR1850和NAT1850在细胞质中可形成双链RNA（dsRNA）。小RNA测序（sRNA-seq）发现了一个在该区域上调的21 nt小RNA，命名为siR1850。siR1850序列来自pri-miR1850链，其中17个核苷酸与miR1850.1重叠，4个与miR1850.2重叠。研究表明，siR1850的产生依赖于DCL1和RDR6，证实其是由pri-miR1850-NAT1850 dsRNA经RDR依赖性途径产生的siRNA。在过表达pri-miR1850和NAT1850的株系中，siR1850积累增加。

2.4 NAT1850和siR1850负向调控水稻低温耐受性

与miR1850.1类似，NAT1850和siR1850的表达在冷胁迫下被抑制。表型分析表明，过表达NAT1850或人工siR1850（asiR1850）的转基因株系，在幼苗期和孕穗期均表现出比野生型更差的耐冷性。具体表现为幼苗存活率降低、叶片萎蔫更严重、活性氧积累更高，以及孕穗期冷处理后花粉育性和结实率显著下降。

2.5 siR1850靶向并抑制NPR3

生物信息学预测和RNA-seq分析发现，siR1850和miR1850.1共同靶向NPR3基因。NPR3的3‘ UTR区域存在两个siR1850的靶位点，它们部分与miR1850.1的靶位点重叠。5’ RACE实验证实siR1850能切割NPR3 mRNA。在过表达NAT1850或asiR1850的株系中，NPR3的转录水平下调，且其冷诱导程度减弱。双荧光素酶报告实验进一步验证了siR1850对NPR3的靶向作用。

2.6 NPR3作为WRKY76的共调节因子在冷胁迫下激活DREB1B

通过酵母双杂交、免疫共沉淀、双分子荧光互补和荧光素酶互补成像等多种技术，证实NPR3与转录因子WRKY76存在蛋白互作。双荧光素酶报告实验表明，NPR3本身不具有转录激活活性，但能作为WRKY76的共激活因子，显著增强WRKY76对下游冷响应基因DREB1B启动子的激活能力。在过表达NPR3的株系中，WRKY76和DREB1B的表达上调；而在NPR3敲除突变体中，它们的表达下调。

2.7 NAT1850-siR1850模块以NPR3依赖性方式调控冷胁迫响应

遗传学证据表明，NAT1850和siR1850作用于NPR3的上游。在NPR3功能缺失突变体（NPR3-KO）背景下，过表达NAT1850或asiR1850并不能使植株的耐冷性进一步恶化。同时，在NPR3-KO背景下，过表达NAT1850或asiR1850也无法改变下游基因WRKY76和DREB1B，以及孕穗期耐冷相关基因CTB3、MAPK3和TPP1的表达水平。这些结果证明，NAT1850-siR1850模块通过NPR3依赖的信号通路调控水稻的低温耐受性。

2.8 NAT1850和siR1850通过独立于miR1850.1-NPR3的途径调控水稻产量

有趣的是，NAT1850-siR1850模块在调控产量方面与miR1850.1-NPR3通路分离。过表达NAT1850或asiR1850导致植株变矮、主穗变短、穗重和每穗粒数减少，但过表达amiR1850.1则不影响产量。转录组分析显示，asiR1850株系中氮代谢相关基因（如NRT2.1、NR1、NR2、NR1.2）显著下调，而amiR1850.1株系中则无此变化。相应地，NAT1850和asiR1850株系的硝酸还原酶（NR）活性、铵根离子（NH₄⁺）和谷氨酰胺（Gln）含量均降低。这表明NAT1850和siR1850通过一个独立于miR1850.1-NPR3的途径调控氮同化和水稻产量。

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3. 讨论

本研究揭示了一种pri-miRNA与其cis-NAT的新型调控模式。pri-miR1850促进其反义链转录本NAT1850的积累，而NAT1850则通过与pri-miR1850形成dsRNA，一方面抑制成熟miR1850s的产生，另一方面经RDR6/DCL1依赖途径产生siR1850。siR1850与miR1850.1功能汇聚，共同靶向抑制NPR3。NPR3作为WRKY76的转录共激活因子，触发DREB1B表达以增强耐冷性。在正常条件下，该模块抑制NPR3表达，避免其高表达导致的生长抑制（生长-防御权衡）；在冷胁迫下，模块表达被抑制，解除对NPR3的抑制，使其快速积累以激活抗冷通路。此外，NAT1850-siR1850模块还通过另一独立通路调控氮同化相关基因，影响水稻产量。该研究为理解非编码RNA互作网络在植物平衡抗逆与生长中的复杂作用提供了新视角。