《Advanced Science》：Liver Stiffness Directs Intrahepatic Cholesterol Accumulation Through YAP/TAZ in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease
摘要
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球最普遍的慢性肝病，其病理谱系广泛，从单纯性脂肪变、脂肪性肝炎到纤维化乃至肝硬化。肝纤维化标志着显著的肝细胞功能障碍的开始，是预测死亡率和肝脏相关事件的主要指标。尽管研究广泛，但有效的治疗策略仍然有限。肝脏硬度已被广泛接受为MASLD严重程度的标准诊断标志物，但其对肝细胞功能的生物学影响尚未得到充分探索。
本研究旨在探究肝脏硬度如何影响肝细胞功能，特别是胆固醇代谢。研究发现，在MASLD患者队列和小鼠模型中，肝内胆固醇水平与肝脏硬度呈强正相关。进一步的机制研究表明，坚硬的基质通过激活Yes相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）来抑制肝脏X受体α（LXRα）的活性。在细胞核内，YAP破坏了LXRα与其异源二聚体伙伴视黄醇X受体α（RXRα）的结合，从而抑制了LXRα的转录活性。一致地，肝细胞特异性敲除Yap/Taz促进了小鼠肝脏胆固醇外流，并延缓了胆固醇诱导的纤维化进展。对MASLD患者肝脏的转录组学分析证实，LXRα靶基因的表达与肝脏硬度以及YAP/TAZ活性呈强负相关。这些发现揭示了MASLD中肝胆固醇水平的机械敏感性调控，表明肝脏硬度是肝细胞功能障碍的一个因果因素。
1 引言
MASLD已成为最普遍的慢性疾病，目前影响全球三分之一的人口。尽管研究广泛，但有效的治疗策略仍然有限，Resmetirom和Semaglutide是目前仅获批准的MASLD疗法，且仅带来适度的抗纤维化益处。
MASLD病理生理学中一个关键但尚未充分探索的方面涉及肝脏的机械特性。肝脏硬度已被广泛接受为MASLD严重程度的标准诊断标志物。健康肝组织表现出显著的柔软性（1–3 kPa），但进行性纤维化可使硬度增加十倍以上（>20 kPa）。然而，这种机械转化对肝细胞功能的生物学后果受到的关注有限。
YAP和TAZ是核心机械传感器，介导细胞对基质硬度、细胞密度、拉伸和压力负荷等机械线索的反应。在成年肝脏中，YAP/TAZ活性主要局限于胆管细胞，但在患者和实验性小鼠模型的纤维化肝脏中，肝细胞中YAP/TAZ活性的增强很常见。因此，肝细胞也可能能够响应基质硬度，特别是在肝纤维化进展期间。
在肝脏中，细胞胆固醇是MASLD进展的关键因素。最突出的肝胆固醇调节因子之一是LXRα，一种肝脏富集的核受体。LXRα的缺失或活性受损会导致MASLD中胆固醇蓄积和肝损伤。然而，控制肝胆固醇的有效方法尚未实现，导致MASLD中胆固醇蓄积的内源性线索仍有待阐明。
机械生物学和胆固醇代谢的交集在肝病背景下很大程度上尚未被探索。然而，最近的一项研究表明，胆固醇可作为激活TAZ的上游输入。这一发现使我们预期，在MASLD中，坚硬基质激活的YAP/TAZ也可能在主动控制细胞内胆固醇水平中发挥作用，这一点尚未被研究。本文假设肝脏硬度通过YAP/TAZ介导的LXRα活性调节直接影响肝细胞胆固醇代谢。
2 结果
2.1 MASLD中肝脏胆固醇含量与组织硬度相关
为了研究肝脏力学与胆固醇代谢之间的关系，我们使用瞬时弹性成像技术测量了MASLD患者的肝脏硬度。从整个229名患者的队列中，34名拥有可用冷冻肝组织的个体根据肝脏硬度被分为3组。我们发现，较硬的肝脏中组织胆固醇水平显著更高。令人惊讶的是，肝脏僵硬患者的肝脏与血清胆固醇比率是肝脏柔软患者的三倍多。在所有参与者中，肝脏硬度与肝脏胆固醇水平之间存在稳健的正相关。此外，在获得的各项临床参数中，肝脏硬度与肝脏胆固醇水平的相关性最强，超过了组织学纤维化分期。
为了进一步研究肝脏硬化与肝脏胆固醇蓄积之间的联系，我们检查了多种饮食诱导的MASLD小鼠模型。一致地，Filipin染色显示，仅在较硬的肝脏中大量蓄积游离胆固醇。在所有模型中，肝脏硬度与肝脏与血清胆固醇比率呈强正相关。接下来，我们利用一个渐进性小鼠模型，通过给小鼠喂食胆碱缺乏、氨基酸定义的高脂饮食（CDAHFD）0、2、4和12周来代表MASLD的每个阶段。正如预期，喂养12周伴随着肝脏硬度的显著增加，而在较早时间点观察到相对较小的变化。与临床观察一致，胆固醇蓄积仅在纤维化肝脏中显著，而在其前阶段则不明显。这与脂滴的形成形成对比，脂滴在脂肪性肝炎发展之前增加，但在纤维化中减少。纤维化肝脏中的肝脏胆固醇含量和肝脏与血清胆固醇比率显著高于脂肪变或脂肪性肝炎的肝脏，表明从循环中蓄积了更多的胆固醇。小鼠肝脏硬度与肝脏胆固醇的正相关支持了这些结果。
2.2 基质硬度决定肝细胞内胆固醇水平
肝脏中胆固醇随着硬度增加而蓄积的观察促使我们研究肝细胞中哪些细胞代谢途径受到机械调节信号的影响。虽然瞬时弹性成像常用于临床测量组织硬度，但原子力显微镜（AFM）用于细胞水平的分辨率。在健康个体中，通过AFM测量的肝脏硬度范围从柔软区域的2.0 kPa到富含胶原蛋白区域的10.9 kPa，部分患者局部硬度超过100 kPa。类似地，小鼠肝脏的平均硬度从1.9 kPa（健康）测量到5.1 kPa（纤维化），某些区域高达50 kPa。为了模拟人肝脏的健康和纤维化微环境，肝细胞被培养在软（1 kPa）或硬（20 kPa）的胶原包被水凝胶上，并进行代谢组学、RNA测序和生化分析。结果，坚硬基质上细胞的细胞内胆汁盐水平显著降低。鉴于胆汁盐是胆固醇代谢的主要产物，这些发现促使我们进一步研究胆固醇相关基因的机械敏感性表达。小鼠原代肝细胞的转录组分析显示，在坚硬表面上，胆固醇代谢相关基因下调，而YAP/TAZ靶基因上调，表明机械转导增强。具体来说，胆固醇代谢途径是前7个显著受影响的途径之一。基因集富集分析（GSEA）进一步证实了胆固醇稳态和胆汁酸代谢基因的高度富集。确实，我们通过生化定量发现坚硬水凝胶上肝细胞内的胆固醇水平显著更高。Filipin染色也显示坚硬水凝胶上肝细胞中胆固醇的机械敏感性蓄积。
接下来，我们进一步分析了参与胆固醇外流、摄取、生物合成和分解代谢的代表性基因的表达。有趣的是，培养在坚硬水凝胶上的原代肝细胞显示所有这些途径的基因表达均降低。在蛋白质水平，ABCG8显著降低，而HMG-CoA还原酶（HMGCR）和CYP7A1基本保持不变。这些发现表明，在坚硬条件下胆固醇生物合成和分解代谢的抑制不是因果机制，而是对细胞内胆固醇蓄积的代偿反应。坚硬基质上的肝细胞表现出显著受损的胆固醇外流以及外源性胆固醇摄取的显著减少。虽然在坚硬水凝胶上胆固醇外流和摄取均减少，但细胞内胆固醇继续蓄积，表明外流抑制占主导地位，而摄取减少代表了适应过量细胞内胆固醇的代偿性适应。
2.3 LXRα活性受基质硬度控制
硬度介导的细胞内胆固醇蓄积出乎意料，因为其他一些细胞类型，如Ras转化的乳腺上皮细胞（MCF10ATk1）和水生化视网膜细胞（RPE1），反应方向相反。这种差异使我们假设肝细胞拥有一个独特的机械敏感性调节模块，控制机械敏感性胆固醇外流。其中，LXRα是一个核受体，它控制将细胞胆固醇输出到细胞外空间的ATP结合盒转运蛋白的转录以及代谢胆固醇的酶。
为了确认LXRα在肝细胞中的功能相关性，使用siRNA沉默了小鼠原代肝细胞中的LXRα表达。正如预期，敲低LXRα显著增加了总细胞和游离细胞胆固醇水平。为了进一步评估LXRα的贡献，来自LXRα敲除小鼠的原代肝细胞被培养在软或硬的水凝胶上。与野生型细胞不同，LXRα缺陷的肝细胞未能响应坚硬基质而蓄积胆固醇，这与其他非肝细胞系的结果相似。此外，在LXRα缺陷的肝细胞中未观察到对胆固醇外流关键的基因表达变化，这表明LXRα是胆固醇外流机械敏感性调节的关键介质。为了研究LXRα活性是否受基质硬度影响，AML12细胞用LXRα的合成配体T0901317处理。在软水凝胶上，T0901317有效促进了胆固醇从肝细胞中去除，表现为Filipin强度降低。然而，在硬水凝胶上，它未能降低胆固醇水平。在原代肝细胞中用LXRα激动剂处理也发现了类似的结果。此外，去除胆固醇所需的胆固醇外流基因的诱导在坚硬基质上显著减弱，为这些发现提供了机制解释。
2.4 YAP/TAZ是LXRα调控的机械传感器
为了确定肝细胞中的主要机械转导途径，从培养在软或硬水凝胶上的肝细胞的RNA测序数据中比较了GSEA。结果，Hippo信号通路显示出显著的富集，而与PIEZO1等其他调节因子相关的钙介导信号通路仅表现出微小的变化。我们证实原代肝细胞能够通过培养在坚硬水凝胶上诱导YAP/TAZ的核定位。这些结果表明肝细胞主要通过YAP/TAZ轴感知基质硬度。
为了确定基质硬度是否以YAP/TAZ依赖性方式调节LXRα活性，我们利用AAV8-TBG-Cre病毒在Yapfl/fl;Tazfl/fl小鼠的肝细胞中删除Yap/Taz。注射后十天，通过免疫印迹证实了肝细胞中Yap/Taz的成功删除。Filipin染色显示，在Yap/Taz缺失的情况下，胆固醇外流显著增加。接下来，对野生型和Yap/Taz敲除的原代肝细胞在不同硬度条件下进行了RNA测序。引人注目的是，基因表达的主成分分析显示，硬度诱导的基因改变在Yap/Taz缺失的情况下显著减弱，凸显了肝细胞严重依赖Yap/Taz进行机械转导信号传导。具体来说，与胆固醇稳态、胆汁代谢和Hippo信号通路相关的机械敏感性基因的转录调控也依赖于Yap/Taz的存在。此外，RT-qPCR分析证实，胆固醇输出蛋白如Abca1和Abcg5的表达在Yap/Taz敲除肝细胞中适度增加。在通过CRISPR-Cas9建立的YAP/TAZ敲除HEK293细胞中，T0901317处理诱导的LXRα靶基因表达显著敏感化，表明YAP/TAZ具有基础的抑制作用。
2.5 LXRα活性受Hippo通路调控
在非再生的成年肝脏中，YAP/TAZ主要受Hippo通路激酶Large tumor suppressor 1和2（LATS1/2）的抑制，有助于维持器官大小。为了评估YAP/TAZ介导的LXRα抑制是否受经典Hippo通路信号控制，我们分析了肝细胞特异性Lats1/2敲除小鼠的肝脏。在Lats1/2敲除肝脏中，LXRα靶基因表达显著较低，而Yap/Taz靶基因较高。为了进一步了解YAP/TAZ激活是否损害LXRα的转录活性，用T0901317处理了LATS1/2敲除HEK293细胞。RT-qPCR分析证实了组成型激活的YAP/TAZ对LXRα的抑制作用，因为与扩增的CTGF转录相反，T0901317未能在LATS1/2敲除细胞中诱导LXRα靶基因表达。
LATS1/2受多种外源性生物物理和生化线索通过上游Hippo通路激酶的调节。我们试图确定Hippo通路调节是否普遍控制LXRα活性，而不论特定的上游刺激如何。我们证实高细胞密度诱导了原代肝细胞中Yap/Taz的细胞质重定位。高细胞密度，一种已知能降低Yap/Taz活性的条件，显著增加了小鼠原代肝细胞中LXRα靶基因的转录并降低了Yap/Taz靶基因的表达。类似地，血清剥夺产生了类似的效果，证实YAP/TAZ活性的降低通常导致LXRα的去抑制。这些数据表明YAP/TAZ和LXRα之间存在关键的相互作用，为坚硬基质如何诱导肝细胞胆固醇蓄积提供了机制见解。
2.6 YAP/TAZ独立于其转录活性抑制LXRα
Hippo通路通过YAP/TAZ的核定位来控制其活性，这被LATS1/2介导的多个丝氨酸残基磷酸化紧密阻止。我们生成了稳定表达5SA-YAP的AML12细胞，这是一种组成型核突变体YAP，其所有LATS1/2磷酸化位点均突变为丙氨酸。正如预期，表达5SA-YAP的细胞有效地阻止了T0901317处理细胞中LXRα促进的胆固醇外流。在野生型细胞中，LXRα靶基因如Abcg1、Abca1、Acaca和Srebf1的表达在T0901317处理后增加。然而，在表达5SA-YAP的细胞中，这些基因的诱导被显著抑制。报告基因实验证实，当YAP存在于细胞核中时，LXR反应元件依赖的启动子活性受到抑制。因此我们测试YAP/TAZ是否与其转录伙伴TEAD协同抑制LXRα。鉴于Ser 94对于TEAD结合不可或缺，我们引入了5SA/S94A突变体YAP，它组成型定位于细胞核但不能形成YAP-TEAD异源二聚体进行转录激活。出乎意料，5SA/S94A-YAP仍然保留了对LXRα的抑制活性，表明YAP/TAZ可能在细胞核内独立于其作为转录共激活因子的角色，直接与LXRα活性相互作用。
2.7 YAP/TAZ破坏LXRα-RXRα异源二聚化及DNA结合
为了进一步理解YAP/TAZ如何干扰LXRα活性，我们研究了LXRα与其不可或缺的异源二聚体伙伴RXRα之间的物理关联。在野生型细胞中，LXRα按预期与RXRα共免疫沉淀。然而，这种相互作用在LATS1/2敲除细胞中被消除。相反，YAP/TAZ敲除细胞与野生型细胞相比表现出更强的异源二聚体结合，表明YAP/TAZ在细胞核中充当复合物形成的天然抑制剂。值得注意的是，YAP在LATS1/2敲除细胞中也与LXRα共免疫沉淀，这增加了YAP与RXRα竞争结合LXRα的可能性。
与RXRα异源二聚化显著增加了LXRα的DNA结合亲和力，这对于有效调节靶基因表达至关重要。使用抗LXRα抗体的染色质免疫沉淀显示，LATS1/2敲除细胞中，LXRα与靶基因ABCG1、ABCG5和ABCA1启动子中LXR反应元件的结合被消除。这表明YAP/TAZ介导的与RXRα的解离导致LXRα的DNA结合受损。使用抗RXRα抗体的额外染色质免疫沉淀实验显示，YAP/TAZ也将RXRα从LXRα靶基因的启动子区域解离。值得注意的是，Yap/Taz敲除肝细胞中LXRα蛋白水平显著更高，表明Yap/Taz也可能促进LXRα的去稳定化。另一方面，YAP和TAZ的表达在LXRα敲除肝细胞中更高，证明了这些因子之间存在相互抑制的调节关系。这些发现揭示了YAP/TAZ活性破坏LXRα-RXRα异源二聚化、损害LXRα DNA结合并进一步促进其更新的新机制。
2.8 肝细胞中Yap/Taz的敲除改善胆固醇诱导的肝纤维化
基于我们的发现，即硬度增加激活的YAP/TAZ促进胆固醇蓄积，我们假设删除YAP/TAZ将阻止肝纤维化进展期间的肝细胞胆固醇蓄积。当比较喂食高脂饮食或添加胆固醇的类似饮食的小鼠时，只有高脂高胆固醇饮食显示显著的肝纤维化诱导，伴随着肝脏硬度增加，总胆固醇和游离胆固醇水平显著诱导。因此，给Yapfl/fl;Tazfl/fl小鼠注射AAV8-TBG-Cre病毒以建立肝细胞特异性Yap/Taz敲除小鼠，并进行胆固醇诱导的纤维化模型实验。病毒注射10天后，基因删除发生在几乎所有肝细胞中。YAP表达的敲除也通过免疫印迹得到确认。
喂食高脂高胆固醇饮食12周后，肝脏组织的生化分析表明，Yap/Taz敲除小鼠的肝脏与血清胆固醇比率明显较低，表明Yap/Taz的缺失导致肝脏胆固醇外流的去抑制。Filipin染色显示，与野生型小鼠相比，喂食高脂高胆固醇饮食后，Yap/Taz敲除小鼠的肝脏游离胆固醇蓄积显著抑制。另一方面，在我们的模型中，甘油三酯水平不受Yap/Taz缺失的影响。这表明在纤维化期间，Yap/Taz主要影响胆固醇外流而非脂肪酸储存。胆固醇诱导的纤维化进展在Yap/Taz敲除小鼠中也显著延迟，这通过Sirius Red染色得到证实。正如预期，参与胆固醇外流的LXRα靶基因的表达在Yap/Taz敲除小鼠中更高。这也通过免疫印迹和免疫组织化学分析得到证实。由于肝脏中Abcg5/8的敲除会损害胆汁胆固醇分泌并驱动肝脏胆固醇蓄积导致肝损伤，在Yap/Taz敲除小鼠中观察到的ABCG8表达增加支持了Yap/Taz缺失对胆固醇蓄积的保护作用。为了确定Yap/Taz是否也参与没有硬度升高的肝内胆固醇水平，我们比较了喂食简单高脂饮食且未添加胆固醇的小鼠。有趣的是，基因型之间在胆固醇代谢或纤维化进展方面没有显著差异。这些表明YAP/TAZ介导的胆固醇调节在机械转导变得明显的僵硬肝脏中更为重要。
2.9 MASLD患者中胆固醇相关的LXRα靶基因与肝脏硬度呈负相关
为了扩展我们在临床环境中关于YAP/TAZ和LXRα机械敏感性调节的发现，我们分析了来自具有不同程度肝脏硬度的MASLD患者的肝组织。总共229名MASLD患者根据通过瞬时弹性成像测量的肝脏硬度被分为软、中和硬亚组。肝组织的转录组分析显示，与软肝脏相比，中和/或硬肝脏中与胆固醇外流相关的LXRα靶基因的转录水平显著降低。相反，YAP/TAZ靶基因随着硬度增加而显著上调。肝脏硬度与LXRα靶基因表达之间的负相关证实了我们的发现，即LXRα在肝脏中受到机械调节。有趣的是，当患者根据纤维化分期分组时，无法观察到这种表达模式，表明肝脏硬度可能作为评估代谢状态的有价值诊断参数，并得到与肝细胞功能直接机制联系的支持。免疫组织化学分析证实，与软肝脏相比，硬肝脏中ABCG8表达较低，YAP活性较高。此外，单细胞RNA测序数据的肝细胞定向分析显示，肝硬化肝脏中与胆固醇外流相关的LXRα靶基因下调，同时CTGF和CYR61表达增加。总之，我们的结果突出了MASLD患者中硬度相关的肝脏胆固醇蓄积，并揭示了YAP/TAZ对LXRα的机械敏感性抑制是其潜在机制。
3 讨论
硬度增加是肝纤维化的一个标志。然而，关于它如何影响肝细胞功能知之甚少。在本研究中，我们发现基质硬度作为一种调节肝脏胆固醇水平的机械线索。我们对人MASLD肝脏的分析表明，肝内胆固醇与肝脏硬度之间存在强关联。培养在坚硬水凝胶上的肝细胞自发蓄积更多胆固醇。从机制上讲，硬度介导的YAP/TAZ激活通过破坏其与RXRα的异源二聚化来抑制LXRα活性。确实，与野生型小鼠相比，Yap/Taz敲除小鼠对肝脏胆固醇蓄积和纤维化进展更具抵抗力。对MASLD患者肝脏的转录组分析进一步证实了LXRα靶基因表达与肝脏硬度及YAP/TAZ靶基因表达之间的负相关。
MASLD中肝纤维化发展的当前观点是受损肝细胞分泌旁分泌因子激活肝星状细胞，其中长期定向细胞间通讯导致细胞外基质过度蓄积。由于这个过程，肝脏在肝纤维化进展期间经历了显著的重塑，这涉及超出生理范围的机械特性变化。本研究提出肝脏硬度的变化不仅仅是纤维蓄积的最终表型结果。这些发现突出了一个机械敏感性反馈回路，其中纤维化诱导的硬度加剧了肝细胞胆固醇蓄积和功能障碍，从而进一步加速纤维发生。虽然早期疾病可能对针对脂肪变或炎症的干预有反应，但伴随纤维化的机械重塑似乎通过直接损害肝细胞代谢来加强疾病进展。这强调了早期治疗干预的临床重要性，并表明一旦组织硬化发生，针对肝细胞的单一疗法可能不足。
根据我们的结果，可以预测对LXRα调节剂等治疗的反应可能因肝脏硬度而异。尽管有前景的临床前证据，但用LXRα配体控制胆固醇水平的临床尝试因缺乏疗效和不良副作用而未成功。有趣的是，使用另一种核受体激动剂Resmetirom也观察到类似情况，其疗效似乎在晚期纤维化患者中减弱。虽然这主要归因于不可逆的肝损伤，但我们的发现提出了组织硬化损害核受体信号传导的可能性，从而导致纤维化肝脏中药物反应性降低。
我们确定的机械敏感性途径代表了MASLD干预的潜在治疗靶点。当前的治疗方法主要侧重于代谢干预，例如GLP-1受体激动剂，这些药物在通过瞬时弹性成像测量肝脏脂肪变和纤维化标志物减少方面显示出前景。然而，我们的发现表明，靶向机械转导通路本身可能提供互补的益处。例如，靶向整合素介导的机械信号通路已显示出治疗肝纤维化的前景。因此，目前为癌症治疗开发的YAP/TAZ小分子抑制剂可能被重新用于肝病。此外，靶向机械转导通路的下游效应物，如特定的胆固醇外流转运蛋白，可能提供额外的治疗方法。
虽然我们的研究为肝脏胆固醇代谢的机械敏感性调节提供了令人信服的证据，但应承认几个局限性。首先，我们的体外实验使用了简化的水凝胶系统，可能无法完全重现纤维化肝脏的复杂机械环境。在纤维化进展期间，肝脏细胞外基质经历了显著的成分变化，超出了硬度变化，这可能影响机械转导途径。此外，我们的患者队列仅限于单一民族，需要在不同人群中进行进一步验证以进行推广。尽管如此，本研究揭示了一种新的机械敏感性途径，它创造了一个恶性循环，其中纤维化诱导的硬度促进进一步的胆固醇蓄积和疾病进展，为理解MASLD病理生理学和确定潜在的治疗靶点提供了新的见解。将YAP/TAZ确定为调节胆固醇稳态的关键肝脏机械传感器，强调了在肝病发病机制和治疗中考虑生物力学因素的重要性，可能导致更有效的靶向纤维化策略。
