KDM4A通过PKCα磷酸化获得H3R17me2a去甲基化活性，促进染色体凝缩 中文标题：KDM4A擦除H3R17me2a表观遗传标记以促进有丝分裂染色体凝缩的新机制

《Advanced Science》：KDM4A Erases the H3R17me2a Mark, Facilitating Chromosome Condensation

本文揭示了细胞有丝分裂进程中染色体凝缩的关键表观遗传调控新机制。研究发现，有丝分裂早期，H3R17me2a这一活跃组蛋白标记被CARM1甲基转移酶失活和KDM4A去甲基酶（通过PKCα磷酸化激活）协同去除。H3R17me2a的清除促进了抑制性标记H3K9me3（由Suv39h1催化）的积累，进而招募染色体乘客复合体（CPC）并促进H3S10磷酸化（H3S10ph），最终完成染色体凝缩。这项工作阐明了组蛋白精氨酸甲基化动态调控与有丝分裂进程之间的精确联系，为理解细胞周期表观遗传调控提供了新视角。

　　

1 引言

有丝分裂过程中的染色体凝缩对于准确的染色体分离至关重要。这一过程由动态的组蛋白修饰驱动，如磷酸化和甲基化。其中，H3S10磷酸化（H3S10ph）和H3K9三甲基化（H3K9me3）是关键的有丝分裂特异性修饰。H3K9me3作为异染色质蛋白1（HP1）的结合平台，协调染色体乘客复合体（CPC）的定位和激活。CPC由Aurora B激酶、INCENP、borealin和survivin组成，确保有丝分裂期间的染色体稳定性。HP1对CPC的早期招募激活了Aurora B，促进H3S10ph，并驱动染色质压缩。尽管这些修饰已被充分研究，但精氨酸甲基化等其他组蛋白修饰与染色体凝缩之间的相互作用仍未得到充分探索。共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1，也称为PRMT4）已成为细胞周期的关键调节因子。在G2/M转换期间，CARM1在S217和S229位点的磷酸化会抑制其酶活性并触发其从细胞核转运到细胞质。然而，CARM1的酶活性抑制在有丝分裂中是否必要尚不完全清楚。染色体凝缩是一个转录沉默的过程，需要去除活跃标记并积累抑制性标记。考虑到CARM1产生转录活跃标记，如H3R17me2a和H3R26me2a，我们假设CARM1失活对于通过防止这些活跃标记的形成来实现正确的染色体凝缩至关重要。

2 结果

2.1 H3R17me2a在有丝分裂期间可逆性减少以促进染色体凝缩

为研究有丝分裂期间CARM1对组蛋白底物甲基化的动态变化，我们分析了10T1/2细胞（正常小鼠胚胎成纤维细胞）整个细胞周期中组蛋白精氨酸甲基化水平。正如预期，CARM1依赖性标记H3R17me2a和H3R26me2a的水平从G2期开始下降，与有丝分裂进入时CARM1酶活性的抑制相吻合，并在有丝分裂退出后恢复。相反，由PRMT6催化的H3R2me2a在有丝分裂期间增加。重要的是，在H3R2甲基化缺陷突变体（H3R2K或H3R2A）过表达的细胞中，有丝分裂期间H3R17me2a水平的降低不如野生型（WT）细胞明显。这支持了PRMT6介导的R17甲基化更倾向于发生在R2未甲基化时的观点。因此，我们假设H3R17me2a和H3R2me2a都会影响H3S10ph和染色体凝缩。在诺考达唑（nocodazole）阻滞的有丝分裂细胞中，CARM1敲低导致H3R17me2a水平更大幅度的降低和H3S10ph水平的同步增加。而PRMT6敲低（降低了H3R2me2a水平）并未显著影响H3R17me2a水平或导致H3S10ph水平的大幅增加，表明H3R17在H3S10ph中起关键作用。实际上，由CARM1敲低或特异性抑制剂（TP-064）引起的H3R17me2a水平降低增加了诺考达唑诱导的H3S10ph水平并缩短了有丝分裂持续时间。这些发现表明，有丝分裂期间CARM1的抑制会降低H3R17me2a，从而引发H3S10ph的增加，促进染色体凝缩。

2.2 H3R17me2a的减少增加了Aurora B水平和染色质结合，诱导H3S10ph

为了研究H3R17me2a水平下降如何影响H3S10ph水平增加，我们首先检测了CARM1敲低或过表达（WT或E266Q突变体）细胞中CPC亚基的水平。我们观察到，只有Aurora B水平随着CARM1 WT过表达而降低，并随着CARM1敲低或E266Q过表达而在蛋白和mRNA水平上增加。这表明尽管H3R17me2a是一个公认的活跃标记，但它可能抑制Aurkb转录，从而调节Aurora B的丰度。TP-064处理（降低了H3R17me2a水平）增加了Aurora B蛋白和mRNA水平。此外，在CARM1敲除（KO）细胞中，通过WT CARM1（而非ΔNLS-CARM1）拯救来恢复H3R17me2a，导致Aurora B蛋白和mRNA水平降低。直接证据来自过表达H3R17K或H3R17A形式，这增加了Aurora B和H3S10ph水平，导致更快的诺考达唑诱导的有丝分裂停滞和更窄的中期板宽度。相比之下，过表达甲基化模拟物H3R17F或磷酸化缺陷型H3S10A则产生了相反的结果，支持了H3R17me2a减少上调Aurkb转录、促进H3S10ph、染色体凝缩和有丝分裂进入的观点。值得注意的是，Aurora B激酶对其底物的活性并未因H3R17甲基化状态而改变。总之，这些发现表明，在有丝分裂期间，CARM1抑制导致H3R17me2a减少，进而增加Aurora B表达及其染色质结合，最终提升H3S10ph水平并促进染色体凝缩和有丝分裂进程。

2.3 有丝分裂期间H3R17me2a的减少增强了Suv39h1与染色质的结合，导致H3K9me3增加

接下来，我们试图确定H3R17me2a的减少如何增加Aurora B与染色体的结合。考虑到CPC向染色体的招募依赖于H3K9me3结合的HP1与INCENP之间的相互作用，我们首先关注H3R17me2a和H3K9me3之间的交互作用。有趣的是，H3K9me3水平在H3R17甲基化缺陷突变体（H3R17K和H3R17A）中增加，而在H3R17甲基化模拟突变体（H3R17F）中降低。这种模式与我们观察到的Aurora B表达和H3S10ph水平的变化一致。总体而言，类似于H3R17me2a和H3S10ph之间的关系，整个细胞周期中H3R17me2a和H3K9me3标记的变化呈负相关。即使在CARM1敲低导致H3R17me2a水平降低的情况下，H3K9me3水平也增加了，这强烈表明H3R17甲基化在调节H3K9甲基化中起作用。由于Suv39h1和Suv39h2是催化H3K9me3的已知酶，我们研究了H3R17me2a是否影响它们与染色质的结合。在H3R17me2a水平降低的条件下（CARM1 KO、敲低或抑制），Suv39h2不受影响；然而，Suv39h1更强烈地结合染色质，增加了H3K9me3水平，进而导致Aurora B与染色质结合增加和H3S10ph水平升高。只有在过表达H3R17F的组中，Suv39h1的招募被抑制，随后H3K9me3以及染色质结合的Aurora B和H3S10ph水平下降。这些发现表明，H3R17me2a和H3K9me3之间的相互作用是通过Suv39h1与染色质的结合介导的。此外，Suv39h1优先催化R17未甲基化的H3上的K9me3，而Suv39h2则不论R17甲基化状态如何都能诱导K9me3。这一结果表明，H3R17甲基化改变了Suv39h1的底物偏好。总之，这些观察结果强烈表明，H3R17me2a是通过Suv39h1介导的H3K9me3和随后的H3S10ph来抑制染色体凝缩和有丝分裂进入的关键标记。

2.4 KDM3A和KDM4A具有精氨酸去甲基化酶（RDM）活性，可在体内擦除H3R17me2a标记

虽然我们已经阐明了H3R17me2a的减少如何促进染色体凝缩，但H3R17me2a水平在有丝分裂期间如何动态调节的基本问题仍未得到解答。精氨酸甲基化被认为是体内可逆的过程；然而，真正的精氨酸去甲基化酶（RDM）尚未被鉴定。最近的一项研究表明，某些赖氨酸去甲基化酶（KDM），包括KDM3A和KDM4A，具有RDM活性，尽管主要是在体外。这表明某些KDM的精氨酸去甲基化发生在特定的体内细胞环境中。然后我们检测了KDM3A、KDM4A、KDM4C、KDM4E、KDM5C、KDM6B、KDM7B或Jumonji结构域蛋白6（JMJD6）是否能在体内使H3R17me2a去甲基化。其中，KDM3A和KDM4A都显示出强大的RDM活性，代表了其已确立的KDM活性之外的功能扩展。因此，我们将研究重点放在这两种酶上。过表达KDM3A或KDM4A导致H3R17me2a水平急剧下降，伴随着Aurkb转录增加、诺考达唑处理诱导的H3S10ph水平升高以及明显的有丝分裂停滞。这些结果与在CARM1缺陷细胞中观察到的效果非常相似。相反，敲低KDM3A或KDM4A会损害RO-3306释放后有丝分裂进程中H3R17me2a的减少，导致H3S10ph水平上升较慢，表明有丝分裂进程明显延迟。总之，这些发现表明KDM3A和KDM4A作为CARM1的对立物，调节H3R17me2a水平，进而影响Aurora B水平和G2/M转换。

2.5 KDM4A在有丝分裂期间被PKCα磷酸化，获得H3R17me2a去甲基化活性

先前的研究表明，重组KDM3A和KDM4A在体外未能使H3R17me2a肽段去甲基化。然而，我们的体内实验显示KDM3A和KDM4A表现出RDM活性，有效擦除H3R17me2a标记。基于此，我们假设KDM3A和KDM4A在有丝分裂期间获得了使H3R17me2a去甲基化的能力。鉴于有丝分裂期间会发生大规模的磷酸化波，我们首先检查了KDM3A或KDM4A是否在此阶段被磷酸化。在G2晚期和有丝分裂期观察到KDM4A的条带偏移，表明发生了磷酸化。事实上，KDM4A磷酸化在诺考达唑阻滞的有丝分裂细胞中显著增加，而KDM3A未检测到变化。与KDM1A（在有丝分裂期间被磷酸化并从染色质释放）不同，KDM4A无论其磷酸化状态如何都保持与染色质结合，这表明KDM4A在整个有丝分裂过程中持续调节染色质动力学。使用Scansite数据库，我们确定蛋白激酶C（PKC）是负责KDM4A磷酸化的激酶。支持这一预测的是，KDM4A磷酸化在PKC激活剂（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；PMA）处理时增加，并被PKC抑制剂（calphostin C）强烈抑制。这些处理不影响KDM4A的染色质结合能力。值得注意的是，H3R17me2a水平因PMA处理而降低，因calphostin C处理而升高。这些发现表明，PKC介导的KDM4A磷酸化使其能够使H3R17me2a去甲基化。因此，这种磷酸化导致Aurkb上调和诺考达唑诱导的H3S10ph水平增加。我们的发现提出了一个引人注目的模型：KDM4A在间期作为H3K9me3和H3R2me2a的去甲基化酶发挥作用，但在有丝分裂期间被PKC磷酸化后，它使H3R17me2a去甲基化。此外，正如先前报道的，PKC在有丝分裂期间磷酸化并抑制CARM1，我们通过PKC诱导的CARM1条带偏移证实了这一点。

2.6 PKCα对KDM4A S504位点的磷酸化使其能够擦除H3R17me2a以及H3K9me3

Scansite数据库预测KDM4A的S504是潜在的PKC磷酸化位点，随后通过质谱分析得到证实。为了研究KDM4A是否通过PKCα介导的S504磷酸化获得H3R17me2a的去甲基化酶活性，我们构建了KDM4A的磷酸化模拟（S504E）和磷酸化缺陷（S504A）突变体。正如预期，使用免疫沉淀的KDM4A进行的体外去甲基化实验表明，S504E突变体（而非WT或S504A）在H3R17me2a肽段上诱导了-28 Da的质量偏移，表明发生了精氨酸去甲基化。此外，PMA处理或过表达PKCα-CA突变体诱导了KDM4A WT的磷酸化，但未诱导S504A突变体的磷酸化。PKC激活也未能降低过表达KDM4A S504A的细胞中的H3R17me2a水平，这与KDM4A WT相反。总之，这些结果将S504确定为KDM4A上主要的PKCα依赖性磷酸化位点，并证明了其在赋予H3R17me2a去甲基化酶活性中的关键作用。一致地，过表达KDM4A S504E降低了H3R17me2a水平，从而增加了Aurkb转录，而过表达S504A则没有这种效果。KDM4A WT相对温和的活性可能归因于细胞环境中上游激酶的部分磷酸化。接下来，我们进行了免疫染色以评估S504的磷酸化如何影响KDM4A的去甲基化酶活性。与WT相比，过表达S504E显著降低了间期和有丝分裂期的H3R17me2a水平，而过表达S504A则导致H3R17me2a水平升高。相反，H3K9me3水平随着S504E的过表达而增加，但不随S504A的过表达而增加。这些结果证实了KDM4A在S504位点的磷酸化对其H3R17me2a去甲基化功能至关重要。

接下来，我们研究了H3K9me3水平如何随着S504E过表达而进一步增加。这种增加可能是由于KDM4A去甲基化酶活性丧失，抑制了H3K9me3去甲基化，或者是因为H3R17me2a减少增强了Suv39h1结合，促进了H3K9甲基化。为了阐明这些可能性，我们进行了Suv39h1敲低实验和体外去甲基化实验。无论S504突变如何，Suv39h1敲低都显著降低了H3K9me3水平。此外，KDM4A WT、S504E和S504A在体外都能有效地使H3K9me3去甲基化，这表明KDM4A S504E在保留H3K9me3去甲基化活性的同时擦除了H3R17me2a。H3R17me2a水平的降低导致Suv39h1招募到染色质，随后恢复H3K9me3水平。最后，我们证实了KDM4A在S504位点的磷酸化影响有丝分裂进入。过表达S504E降低了H3R17me2a水平，增加了Aurora B水平，并恢复了H3K9me3水平，从而促进了诺考达唑诱导的有丝分裂停滞。相比之下，过表达S504A则产生相反的效果。总之，我们的研究表明，在有丝分裂期间，PKCα诱导的KDM4A S504磷酸化不仅促进了H3R17me2a去甲基化和Aurkb上调，而且还招募Suv39h1到染色质，导致H3K9me3恢复和随后的H3S10ph水平增加。这些连续事件促进了完整的染色体凝缩和有丝分裂进入。

3 讨论

这项研究通过阐明染色体凝缩过程中活跃和抑制性组蛋白标记之间的相互作用，为调节有丝分裂的分子机制提供了关键见解。具体来说，活跃的组蛋白标记H3R17me2a的水平在有丝分裂早期阶段下降，并在后期阶段恢复。这与抑制性标记H3K9me3呈负相关，这种精细调控的过程控制了CPC的染色质招募和有丝分裂进程。本研究对文献的一个关键贡献是阐明了H3R17me2a水平如何下降。通过鉴定KDM3A和KDM4A作为H3R17me2a的去甲基化酶，我们确定了有丝分裂表观遗传调控的新参与者。KDM4A在间期使H3K9me3和H3R2me2a去甲基化；然而，在有丝分裂期间，PKCα的磷酸化改变了其底物偏好，使其能够对H3R17me2a进行去甲基化，并相对降低了对H3R2me2a的活性。这种磷酸化依赖的底物偏好转变似乎是KDM4A特有的。值得注意的是，KDM3A缺乏与KDM4A S504相当的丝氨酸/苏氨酸残基，并且在我们实验条件下未检测到KDM3A的磷酸化依赖性变化。然而，包括PhosphoSitePlus和Scansite在内的公共数据库预测，KDM3A可能在多个残基（如T308、S446、T668或Y1303）被磷酸化，特别是在G2/M期。这些观察结果提出了KDM3A活性可能在特定环境中受磷酸化或其他翻译后修饰（PTM）调控的可能性。阐明这些调控机制可能有助于调和体外和体内去甲基化活性之间的差异，并有助于更全面地理解RDM的生物学作用。研究这些可能性是未来研究的重要方向，也是我们正在进行的重点工作。

在G2/M期，PKCα介导的磷酸化抑制了CARM1依赖的H3R17甲基化，并同时促进了KDM4A介导的H3R17me2a去甲基化，导致H3R17me2a总体水平降低。这些事件增强了Suv39h1向染色质的招募以加载H3K9me3，随后顺序加载H3S10ph，从而完成染色体凝缩。在染色体凝缩涉及的众多因子中，CPC向染色质的招募起着关键作用。在G2晚期，结合在H3K9me3上的HP1将INCENP招募到着丝粒异染色质，随后是Aurora B介导的H3S10ph，这在一项称为组蛋白H3甲基-磷酸化开关的过程中将HP1从染色体上置换。在有丝分裂早期，H3R2me2a由PRMT6介导，并将CPC定位在染色体臂上，之后Haspin介导的H3T3ph将CPC重新定位到着丝粒，促进H3S10ph并促进染色体凝缩。在有丝分裂晚期，H3T3ph的去磷酸化和有丝分裂驱动蛋白样蛋白2将CPC从着丝粒重新定位到中央纺锤体，启动胞质分裂。尽管额外的组蛋白修饰在有丝分裂期间发生动态变化，但其功能意义仍不清楚。

我们的研究表明，H3R17me2a水平的降低是驱动染色体凝缩的关键早期事件，因为它与Aurora B表达增加和Suv39h1向染色质的招募增强相关。H3R17me2a缺失导致Aurora B水平升高的分子机制仍未解决。鉴于H3R17me2a通常与转录活跃的染色质相关，其减少可能通过更广泛的染色质变化间接影响Aurora B mRNA的表达或稳定性，而不是通过直接的调控相互作用。重要的是，我们的发现将H3R17me2a减少定义为连接转录相关组蛋白修饰动态与有丝分裂染色质结构的早期染色质转变。这突出了组蛋白修饰之间的相互作用在协调染色体凝缩和有丝分裂进程中的重要性，强调了组蛋白精氨酸甲基化在有丝分裂控制中的关键作用。

4 实验方法

4.1 细胞培养

10T1/2、MEF和HEK293T细胞在补充了10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的杜尔贝科改良 Eagle 培养基中培养。所有细胞在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中维持。

4.2 化学品、质粒和抗体

列出了所使用的化学品、构建或获得的质粒以及用于免疫印迹、免疫沉淀或免疫染色的抗体。

4.3 免疫染色和活细胞成像

描述了细胞固定、透化、抗体孵育、共聚焦显微镜成像以及用于时间推移显微镜的GFP-H2B稳定表达细胞系的培养和图像采集方法。

4.4 染色体铺片分析

描述了使用改良的低渗膨胀法进行染色体铺片以用于免疫染色。

4.5 免疫印迹和免疫沉淀

描述了细胞裂解、蛋白质定量、免疫沉淀、SDS-PAGE、转膜、抗体孵育和ECL检测的标准方法。

4.6 组蛋白提取

描述了从细胞核中酸提取组蛋白的步骤。

4.7 体外甲基化分析

描述了使用免疫沉淀的蛋白（CARM1或PRMT6）与组蛋白肽段及SAM进行的精氨酸甲基化分析，以及使用免疫沉淀的Suv39h1或重组Suv39h1蛋白与总组蛋白提取物及SAM进行的赖氨酸甲基化分析。

4.8 细胞同步化和流式细胞术分析

描述了使用RO-3306、BI2536或诺考达唑诱导G2/M期停滞，使用诺考达唑处理后用MG132释放以获得中期停滞细胞的方法，以及使用PI染色和Alexa Fluor 488偶联的抗H3S10ph抗体通过流式细胞术分析细胞周期分布和区分有丝分裂细胞。

4.9 体外激酶分析

描述了使用重组Aurora B蛋白与总组蛋白提取物及ATP进行的激酶反应。

4.10 定量实时PCR

描述了总RNA提取、cDNA合成以及使用SYBR Green染料和实时PCR系统进行mRNA表达定量分析的方法。

4.11 亚细胞分级分离

描述了分离染色质组分的步骤，包括细胞裂解、核分离和染色质提取。

4.12 PTM分析

描述了从SDS-PAGE凝胶中切取KDM4A免疫沉淀物条带、胶内酶解、肽段提取和质谱分析（使用Q Exactive HF-X质谱仪和PRM模式）以鉴定KDM4A在S504位点的磷酸化。

4.13 体外去甲基化分析

描述了使用免疫沉淀的KDM4A蛋白、H3肽段、α-酮戊二酸、抗坏血酸钠和硫酸亚铁铵进行的去甲基化反应，以及使用高效液相色谱-质谱联用系统分析去甲基化产物。

4.14 统计分析

描述了使用Prism软件进行统计分析，数据以均值±标准差表示，使用非配对t检验比较两组数据，显著性水平设定为p < 0.05。