《Clinical and Translational Medicine》：P2X7R deficiency alleviates cardiac senescence by enhancing mitophagy via the HuR/TRIM26/NR4A1 axis
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本文揭示了P2X7受体（P2X7R）在心脏衰老中的关键作用及其分子机制。研究发现，P2X7R在老年人和老年小鼠心脏中表达上调，其缺失可通过促进RNA结合蛋白HuR的核质穿梭，增强E3泛素连接酶TRIM26的mRNA稳定性及表达，进而促进核受体NR4A1的泛素化降解，最终抑制心肌细胞线粒体自噬并加速心脏衰老。该研究首次阐明了P2X7R通过HuR/TRIM26/NR4A1信号轴调控心脏衰老的新机制，为干预年龄相关心功能下降提供了潜在的治疗靶点。
引言
衰老是所有高等生物普遍的生物学过程，会导致主要器官系统的进行性退化。随着人口老龄化趋势加剧，老年人心脏功能障碍的患病率持续上升。心脏衰老的标志之一是线粒体功能障碍，特别是受损的线粒体自噬——一种负责降解受损线粒体的选择性自噬过程。年龄增长导致氧化磷酸化效率下降，活性氧（ROS）生成增加，破坏线粒体动力学并进一步阻碍线粒体自噬。受损的线粒体自噬在年龄相关性心力衰竭的发病机制中起关键作用。嘌呤能受体家族，尤其是P2X7受体（P2X7R），是一种ATP依赖性三聚体离子通道，在调节钙信号和炎症反应中起重要作用，在多种心血管疾病的发病机制中扮演关键角色。然而，P2X7R在心脏衰老中的作用和潜在机制研究仍然有限。
P2X7R在老年人群血清和老年小鼠心脏组织中的表达
本研究首先评估了不同年龄（年轻、中年、老年）人群血清中的P2X7R水平，发现P2X7R表达随年龄增长显著上调。在自然衰老的小鼠中，P2X7R在心脏组织中的表达也显著升高。免疫荧光染色显示，在老年小鼠心脏组织中，P2X7R与α-辅肌动蛋白阳性的心肌细胞共定位，表明其在心脏衰老过程中主要表达于心肌细胞。在体外，用D-半乳糖（D-gal）诱导HL-1心肌细胞衰老，P2X7R表达呈浓度依赖性增加。使用P2X7R药理抑制剂A438079可显著抑制衰老标志物p21、p53和p16的表达，并减少衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞，提示P2X7R可能是细胞衰老的关键调节因子。
P2X7R缺陷延缓小鼠衰老并减轻衰老诱导的心脏重塑
为了研究P2X7R在心脏衰老中的潜在作用，研究人员使用了全身性P2X7R基因敲除（P2X7R-/-）小鼠。与同龄野生型（WT）老年小鼠相比，P2X7R-/-老年小鼠毛发更密更光滑。超声心动图评估显示，WT老年小鼠出现显著的心功能不全和心脏肥厚，而P2X7R缺陷显著减轻了这些年龄相关的心脏损伤。组织学分析进一步证实，P2X7R缺陷显著改善了WT老年小鼠出现的心脏结构异常、心脏纤维化和心肌细胞横截面积增加。此外，P2X7R缺陷有效降低了心脏组织中衰老蛋白p21、p53和p16的表达，SA-β-Gal染色也显示出一致趋势。这些发现表明，P2X7R缺陷延缓了小鼠衰老，并改善了衰老引起的心脏异常。
P2X7R介导衰老心脏中的ROS产生和线粒体功能障碍
线粒体异常是衰老的关键病理标志。透射电镜评估显示，WT老年小鼠心脏组织中线粒体明显肿胀、嵴丢失，而P2X7R缺陷有效逆转了这些线粒体超微结构异常。对血清丙二醛（MDA）含量和心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的评估表明，WT老年小鼠血清MDA水平显著升高，心肌SOD活性降低，这些改变可被P2X7R缺陷所削弱。同时，促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）在WT老年小鼠心脏组织中水平显著升高，而在P2X7R-/-老年小鼠中这些升高被消除。对线粒体自噬关键蛋白水平的评估显示，与WT年轻小鼠相比，WT老年小鼠心脏组织中PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）-PARK2（Parkin）通路活性和LC3-II表达显著降低，而Sequestosome-1， SQSTM1（P62）表达升高，提示心脏线粒体自噬受损。值得注意的是，这些与衰老相关的线粒体自噬缺陷可被P2X7R缺陷所减轻。
P2X7R缺陷通过增加NR4A1表达减轻衰老诱导的心脏线粒体自噬
为探究P2X7R介导心脏衰老和线粒体自噬受损的潜在分子机制，研究人员进行了心脏转录组测序分析。在差异最显著的基因中，核受体亚家族4组成员A1（NR4A1）因其在调控衰老和线粒体自噬中的已知作用而成为关键候选基因。在衰老小鼠心脏组织和D-gal刺激的HL-1心肌细胞中，NR4A1蛋白表达均显著下降，而P2X7R缺陷或抑制可逆转这种下降。随后的细胞实验表明，抑制NR4A1活性会加剧D-gal诱导的衰老表型和受损的线粒体自噬，而过表达NR4A1则能显著改善D-gal诱导的衰老表型并恢复线粒体自噬功能。共转染实验进一步证实，P2X7R过表达显著加剧了D-gal诱导的衰老表型和线粒体自噬受损，而这些效应可被NR4A1过表达所逆转。这些发现表明，P2X7R通过抑制NR4A1来抑制线粒体自噬，从而促进心肌细胞衰老。
为了阐明心脏特异性P2X7R–NR4A1轴在心脏衰老和线粒体自噬中的作用，研究人员使用携带心脏特异性启动子（cTnT）的腺相关病毒血清型9（AAV9）在心肌细胞中特异性过表达P2X7R或NR4A1。在D-gal诱导的衰老小鼠模型中，心肌细胞特异性过表达P2X7R显著加剧了心脏功能障碍和心脏肥厚，而同时过表达NR4A1则能明显减轻这些不良反应。心脏结构、心脏纤维化、心肌细胞横截面积、心脏衰老和线粒体自噬等相关指标也表现出相似的趋势。这些结果共同表明，NR4A1是心肌细胞特异性P2X7R促进心脏衰老的下游效应因子。
TRIM26直接结合NR4A1并促进其降解
研究发现，NR4A1蛋白水平的下降幅度远大于其mRNA水平的变化，提示调控可能涉及翻译后修饰。在泛素-蛋白酶体系统中，E3连接酶是关键。通过对GEO数据集的分析和验证，发现三结构域蛋白26（TRIM26）的mRNA和蛋白水平在衰老的WT心脏中显著上调，但在衰老的P2X7R-/-心脏中下降。免疫共沉淀实验证实，TRIM26与NR4A1存在物理相互作用。在HL-1心肌细胞中，沉默TRIM26会增加NR4A1蛋白水平，而过表达TRIM26则会降低NR4A1蛋白水平。环己酰亚胺追踪实验显示，TRIM26促进NR4A1蛋白降解。使用蛋白酶体抑制剂MG132能有效逆转TRIM26介导的NR4A1降解，而自噬抑制剂则无效，表明NR4A1蛋白是通过蛋白酶体途径降解的。此外，在TRIM26沉默的细胞中，NR4A1的泛素化水平显著降低。这些结果共同表明，TRIM26直接结合NR4A1并通过泛素化促进其降解。
P2X7R通过HuR稳定TRIM26 mRNA并减少其在衰老心脏中的降解
P2X7R在mRNA和蛋白水平上均调控TRIM26的表达。研究人员推测，P2X7R缺失导致的TRIM26表达下降可能源于合成减少或mRNA降解增加。mRNA稳定性实验表明，P2X7R拮抗剂A438079缩短了TRIM26 mRNA的半衰期，提示P2X7R影响TRIM26 mRNA的稳定性。RNA结合蛋白HuR是转录后基因表达的调节因子，通常通过结合靶标mRNA 3‘非翻译区（UTR）中的AU富集元件（ARE）或U富集基序发挥作用。有趣的是，TRIM26 mRNA的3‘UTR中存在多个ARE或U富集基序，这是HuR的潜在结合位点。实验发现，D-gal处理促进了HuR从核到质的穿梭，增加了其与TRIM26 mRNA的结合，从而稳定并上调了TRIM26表达，而这些效应可被A438079显著消除。值得注意的是，HuR的总蛋白水平和mRNA水平在体内外均未发生显著变化，表明P2X7R介导的心脏衰老仅涉及HuR核质穿梭的改变。RNA免疫沉淀（RIP）实验进一步验证，HuR直接结合WT老年小鼠心脏组织中的TRIM26 mRNA，而这种相互作用在P2X7R缺陷后显著减少。这些结果表明，P2X7R特异性诱导HuR核穿梭，从而增加HuR与TRIM26 mRNA的结合，最终改变心肌细胞中TRIM26的表达。
讨论
本研究首次阐明了P2X7R在心脏衰老中先前未被认识的作用。首先，发现人类血清P2X7R水平随年龄增长而逐步升高，而老年小鼠心脏P2X7R表达上调与心功能下降和线粒体自噬受损相吻合。其次，P2X7R缺陷减轻了衰老诱导的心脏重塑和功能障碍，改善了老年心脏的衰老特征并恢复了有缺陷的线粒体自噬。相反，心肌细胞特异性P2X7R过表达加剧了D-gal诱导的心脏功能障碍，加速衰老，并进一步破坏了D-gal诱导的线粒体自噬。第三，研究证明P2X7R通过促进HuR的核质穿梭来调节心肌细胞线粒体自噬，从而增加TRIM26 mRNA稳定性并促进NR4A1的泛素化介导的降解，最终抑制线粒体自噬。总之，这些发现表明P2X7R通过调节HuR/TRIM26/NR4A1轴和损害线粒体自噬，成为心脏衰老的关键驱动因素。
尽管本研究提供了P2X7R在心脏衰老中的新见解，但仍存在一些局限性。例如，循环P2X7R水平与心脏P2X7R表达的相关性仍需在人类心脏组织中进行直接验证。全身性P2X7R敲除模型观察到的心脏衰老益处可能涉及非心肌细胞群的贡献，未来需要使用心肌细胞特异性条件性敲除模型来明确P2X7R信号在衰老心脏中的细胞自主作用。此外，P2X7R激活如何与HuR的核质穿梭相关联，其具体分子机制仍有待完全确定。最后，研究仅使用了雄性小鼠，这显著限制了研究结果的普遍性。性激素等因素可能影响P2X7R信号传导、NR4A1功能或对年龄相关线粒体自噬下降的整体易感性。
总结
综上所述，利用P2X7R敲除小鼠和特异性抑制剂，本研究阐明了P2X7R通过损害心肌细胞线粒体自噬来介导衰老诱导的心脏功能障碍。该研究（1）提供了人类血清P2X7R水平与年龄正相关的直接证据；（2）揭示了P2X7R在介导小鼠衰老诱导的心脏改变中先前未被认识的关键作用；（3）阐明了一种新机制，即P2X7R通过HuR/TRIM26/NR4A1轴促进心脏衰老，从而调节ROS水平和心脏线粒体自噬。这些发现为老年小鼠心脏功能障碍的分子事件提供了新见解，并证明P2X7R过表达会加剧心脏衰老，揭示了P2X7R是年龄相关心功能下降的潜在新型治疗靶点。
