高龄母源性代谢改变在卵母细胞中的跨代传递：氧化应激与脂质稳态失衡的世代影响

《Aging Cell》：Intergenerational Transmission of Metabolic Changes in Oocytes From Aged Mice

本研究深入探讨了高龄妊娠小鼠卵母细胞代谢变化的跨代遗传机制，揭示了卵母细胞内氧化应激诱导的脂质积累如何影响胎儿发育及成年后代谢，并首次证明这种脂质代谢异常可经由雌性生殖系传递至第三代，为理解高龄妊娠对后代健康的长期影响提供了新视角。

　　

1 引言

随着全球范围内女性生育年龄的推迟，高龄母亲(AMA)妊娠已成为一个普遍现象，这可能对后代健康产生深远影响。尽管已知AMA是妊娠成功和子代健康的主要风险因素，但其跨代效应的机制仍未充分探索。研究表明，在人类和小鼠中，高龄雌性个体的卵巢卵泡细胞存在与年龄相关的脂质氧化损伤增加，这引发了人们的担忧：AMA子代的抗氧化系统可能从受孕前就已被削弱，使其更易受到氧化应激(OS)的影响。此外，线粒体作为通过母系传递的细胞器，为AMA相关的改变在多代子代中遗传提供了潜在途径。

本团队先前的研究已证实，高龄雌性（AMA F₀）的卵母细胞会积累胞质内脂滴(LDs)，并且这种卵母细胞脂质氧化变化会持续到植入前胚胎阶段。然而，这种改变是由于表观遗传重编程、胚胎中持续的氧化应激，还是因为植入前胚胎需要更长时间才能恢复至健康的脂质水平，目前尚不清楚。本研究旨在探究这些氧化变化是否会传递给胎儿，对新生儿和成年器官发育产生何种影响，以及这些变化如何实现跨代遗传。

2 结果

2.1 老龄卵母细胞中的脂滴积累

研究证实，与年轻雌性(YMA)相比，老龄雌性（AMA F₀）的卵母细胞存在LDs的积累。通过拉曼光谱成像和相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)分析，发现老龄卵母细胞中LDs覆盖的细胞面积增加，并且大型LDs的数量增多。这些LDs倾向于聚集在细胞质膜和细胞核附近，这种定位可能使过氧化脂质和有毒的ROS产物更容易损伤其他细胞膜成分，进而影响胚胎和胎儿的发育。

2.2 AMA来源的胎鼠生长受限及肝脏和大脑中抗氧化剂水平升高

研究关注了脂质丰富的器官（肝脏和大脑），因为这些器官对氧化应激高度敏感。在自然妊娠的AMA子一代（NP AMA F₁）胎鼠中，胚胎第16天(E16)的胎肝中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平均升高，提示抗氧化能力代偿性上调，间接反映了氧化应激的增加。值得注意的是，即使将AMA F₀的胚胎移植到年轻受体子宫内发育（ET AMA F₁），这种谷胱甘肽状态的改变依然存在，这表明观察到的氧化还原失衡主要由卵母细胞驱动的AMA效应所致，而非高龄子宫环境造成。

研究还发现，在E16时，ET AMA F₁胎鼠的脑重量显著降低，表明由于卵母细胞质量欠佳导致的生长受损。接近妊娠足月时，NP AMA F₁胎鼠在E19时的大脑中也表现出更高的GSH和GSSG水平。此外，NP AMA F₁胎鼠在E19时表现出更低的胎儿体重、更高的胎盘重量以及降低的胎儿-胎盘重量比(F:P)，这反映了胎儿生长受损和胎盘效率低下。相比之下，ET AMA F₁组的胎儿和胎盘重量与年轻对照组相当，表明在年轻子宫环境中妊娠可以部分使胎盘功能正常化。然而，胚胎移植后的存活率在ET AMA和ET YMA组间没有差异，说明卵母细胞的年龄并不会显著损害胚胎着床或早期生存能力。

2.3 AMA子代和孙代的异常代谢调控

有大量证据表明，AMA妊娠与子代代谢健康受损有关。本研究发现，NP AMA F₁幼鼠在所有生长发育阶段的体重均显著增加，但到成年期时体重恢复正常。这种表型似乎在第一代AMA子代中最为明显，在第二代和第三代中仅观察到轻微的体重改变。然而，健康后果可能持续存在，因为即使到了第三代（NP AMA F₃），幼鼠的存活率也显著低于年轻对照组。

有趣的是，在胚胎移植衍生的第三代（ET AMA F₃和ET YMA F₃）幼鼠中观察到了不同的效应。它们在出生后第7天(PND7)体重较低，但这种影响在其他发育阶段未观察到，且生存率无差异。这表明胚胎移植手术本身可能对胚胎和胎儿施加了代谢改变。

在成年雌性血清中，观察到NP AMA F₂和ET AMA F₃个体的胰岛素水平显著低于年轻对照组。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析显示，第一代和第二代NP AMA成年子代循环代谢物水平较低，但到第三代未持续。这些结果指向了广泛的代谢重编程以及AMA子代小鼠脂质合成和转运效率的降低。

有趣的是，雄性血清显示出与雌性不同的代谢重编程模式。NP AMA F₁雄性血清中的胰岛素水平显著高于所有其他组。这种高胰岛素浓度并未遗传给下一代。蛋白质二级结构也受到影响，NP AMA F₃和ET YMA F₃样本的α-螺旋/β-折叠比率低于NP YMA，这是氧化应激条件的指标。

通过FTIR对成年肝脏样品的分析进一步证实了AMA子代成年个体的代谢失调。其中一个持续失调的代谢物是磷脂酰乙醇胺(PE)，它在NP AMA F₁和F₂雄性肝脏中水平较低，但在NP AMA F₁和ET AMA F₃雌性肝脏中水平较高。PE的失调是氧化还原状态改变的一个标志，并被认为是氧化应激损伤的生物标志物。

2.4 AMA来源卵母细胞中的代谢改变

考虑到衰老与氧化应激升高之间的关联，以及脂质因其比DNA或蛋白质更易发生过氧化而成为氧化应激的优先靶点，研究人员利用FTIR研究了高龄雌性（NP AMA F₀）生发泡期(GV)卵母细胞的脂质谱。研究发现，与年轻对照组相比，AMA F₀卵母细胞中脂质和其他代谢物显著增加。引人注目的是，在高龄组的第三代年轻小鼠（NP AMA F₃）的GV卵母细胞中也观察到了类似的结果。

层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)一致表明，NP AMA F₀和NP AMA F₃组的分子谱密切相关，而与YMA的卵母细胞明显分离。这表明，尽管与正常年龄的伴侣连续繁殖，NP AMA卵母细胞中的脂质改变仍可跨代传递。这种改变的代谢特征在F₃代中持续存在，而F₃代的母体（F₂代）本身从未暴露于高龄子宫环境，这提示了一种与种系介导的遗传相一致的机制。

拉曼光谱数据还显示，AMA来源的卵母细胞中线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)的关键调节因子和底物显著增加，如细胞色素C、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和脂肪酸。所有这些成分的增加表明，为了在应激下维持线粒体功能，发生了代偿性的代谢转变。FTIR光谱数据显示，与YMA卵母细胞相比，NP AMA F₀和NP AMA F₃卵母细胞中结构脂质和信号脂质（包括PE、鞘磷脂(Sph)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、羟基化胆固醇(Hchol)和醚连接磷脂酰胆碱(PC O-)）的水平升高。这种膜相关脂质的富集表明，为满足增加的能量需求和应激适应，对线粒体和细胞膜重塑的需求增强了。

2.5 AMA来源的卵母细胞富含视黄醇类，且在第三代中得以维持

鉴于维生素A组分（类胡萝卜素、视黄醇、视黄醛和视黄酸）在OXPHOS功能中的重要性，以及先前研究发现视黄醇类物质定位于颗粒细胞和卵母细胞并与老龄卵母细胞中的LD聚集相关，研究人员进一步详细研究了AMA来源卵母细胞中的视黄醇系统。

通过对FTIR和拉曼光谱进行光谱解卷积分析，发现在NP AMA F₀和NP AMA F₃卵母细胞中，与类胡萝卜素、视黄醇、视黄醛、视黄酸相对应的拉曼峰强度增加。FTIR也证实了在NP AMA F₀和NP AMA F₃卵母细胞中，视黄醇、视黄醛和视黄酸的吸光度增加。

二维光谱相关性分析和PCA分析揭示了各组之间视黄醇调节的不同模式。NP YMA卵母细胞中视黄醇组分之间呈弱相关或相互独立，表明其视黄醇稳态较为灵活。相比之下，NP AMA F₃卵母细胞表现出相互依赖的信号，而NP AMA F₀卵母细胞则显示出强正相关，表明在应对衰老和累积的应激时，视黄醇代谢紧密耦合。视黄醇通过氧化反应不可逆地转化为其完全氧化形式——视黄酸，这可被解释为氧化应激加剧的迹象。结合已知事实和本研究结果，研究人员推测NP AMA F₀和NP AMA F₃卵母细胞中维生素A组分水平升高是由于氧化应激增加所致。

3 讨论

本研究的一个一致发现是，与年轻对照组相比，高龄雌性的卵母细胞含有更高的脂质水平。关于脂质在老龄雌性生殖细胞中积累的原因，需考虑到卵母细胞在很大程度上依赖于颗粒细胞提供代谢物；它们从周围的细胞和卵泡液中获取脂肪酸，并将其储存在脂滴(LDs)中以备后用。这种微妙平衡的破坏，例如缺乏支持性细胞邻居会导致脂质水平下降，而肥胖的卵泡环境则会增加脂质向卵母细胞和胚胎的转移。脂质供应不足或过量都会严重影响卵母细胞的质量和成熟过程。本研究中在AMA卵母细胞中观察到的脂肪酸超载（即脂毒性）已知会损害氧化磷酸化(OXPHOS)——这是细胞能量代谢的关键途径。

对AMA卵母细胞中脂质积累的解释可能与其伴随衰老发生的全身性代谢变化有关，包括体重指数(BMI)增加。因此，AMA卵母细胞中脂质的积累可能只是全身脂质过剩导致的代谢失衡的结果。另一种可能的解释是，老龄机体的氧化状态直接导致了脂质积累。重要的是，虽然我们的测量主要反映抗氧化状态和代谢物丰度，而非直接的氧化损伤，但观察到的谱图与经历氧化还原失衡的细胞环境是一致的。LDs除了储存脂肪酸和视黄醇类物质外，还可以隔离受损或过氧化的脂质，保护线粒体和内质网(ER)等膜结构——这两个细胞器在AMA卵母细胞中受影响最严重。重要的是，过氧化脂质会降低膜厚度并增加对ROS的通透性，促进对细胞的进一步损伤。

基于此卵母细胞表型，我们观察到NP AMA F₁胎鼠在E16和E19出现发育受损，表现为胎肝和胎脑中抗氧化剂水平升高、胎盘效率降低以及脑重量减轻。重要的是，尽管在年轻子宫环境中妊娠，ET AMA F₁在胎肝和脑氧化还原状态上显示出与NP AMA F₁相似的改变。这些数据表明，观察到的氧化变化是卵母细胞驱动的，而非子宫依赖性的，突显了AMA效应从卵母细胞持续到胎儿发育阶段。这一发现与现有证据——即AMA卵母细胞和囊胚中线粒体功能障碍和代谢表观遗传改变——以及AMA对胎儿发育的不利影响相一致。研究人员提出，源于卵母细胞的脂质代谢受损是观察到的胎儿器官形成缺陷的基础，这与脂质可用性、氧化还原平衡和器官发生之间已建立的关联相符。

在NP AMA F₁和ET AMA F₁胎儿器官中观察到的氧化变化在成年期表现为代谢表型。成年肝脏的FTIR分析揭示了脂质类别的失调，特别是磷脂酰乙醇胺(PE)和视黄醇类物质。PE已知对过氧化作用敏感，其失调可作为氧化还原状态改变的标志。对肝脏和神经元功能至关重要的视黄醇类物质也出现失衡，表明早期生命氧化损伤导致了广泛的脂质代谢转变。

与先前报道一致，AMA子代表现出体重改变和代谢失调，伴随血清脂质失衡、蛋白质二级结构改变和胰岛素水平紊乱。这些观察结果与“安静胚胎假说”相符，该假说认为代谢活动增加反映了细胞对损伤的代偿反应。血清谱的性别特异性差异进一步突显了AMA诱导的程序化效应的复杂性。跨代观察到的新生儿死亡率升高将高龄母亲与不良围产期结局联系起来。

成年肝脏和下丘脑中失调的脂质代谢与认知衰退、细胞衰老和氧化应激有关，如在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等疾病中所观察到的。改变的代谢表型与大脑健康密切相关。大脑中的脂质损伤尤其成问题，因为血脑屏障限制了营养交换，而且分裂后神经元的脂质更新率很低。神经元和卵母细胞由于其非分裂特性，都易受脂质损伤。

延伸这些观察，研究人员证明在F₁代成年组织中观察到的脂质和视黄醇失调在F₃代卵母细胞中重现，这为AMA诱导的代谢和氧化应激特征的跨代遗传提供了直接证据。视黄醇系统及其组成部分在氧化应激中，特别是在肝脏组织和预防肝脏疾病中的作用日益受到重视。视黄醇系统可能在高氧化应激环境中发挥保护作用，这与其支持卵母细胞成熟和减轻氧化损伤的作用一致。

4 结论

本研究全面概述了高龄母亲(AMA)妊娠的多代效应，其特征是卵母细胞中的氧化应激损伤和脂滴(LDs)积累导致胎儿发育受损和成年后代谢重编程，最终引起卵母细胞脂质失调，从而延续跨代循环。与“健康与疾病的发育起源”(DOHaD)假说一致，本研究表明受孕和妊娠期间的条件可以对后代健康产生持久影响，其后果可能持续多代。

研究发现有助于越来越多的证据强调，辅助生殖技术(ART)应超越评估粗略的形态学特征，转而结合检测生殖细胞中更细微的细胞和分子变化。将新方法引入市场将使受精前评估卵母细胞质量成为可能。新兴的非破坏性损伤检测、基于人工智能的预测建模、精确的机器人胚胎操作和个性化治疗方案等进展，为优化卵母细胞选择和改善子代长期结局提供了有前景的机会。