《British Journal of Cancer》：Attenuation of the CpG island methylator phenotype and lack of WNT signalling activation restrains Kras mutant intestinal neoplasia
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本文为解决KRAS突变为何在锯齿状肿瘤中罕见且恶性潜力低于BRAF突变的难题，研究者系统比较了小鼠模型中致癌性KRAS和BRAF诱导的肠道病变差异。结果表明，KRAS突变虽然也能诱导锯齿状肿瘤，但潜伏期显著更长、外显率更低，且其肿瘤表现为CIMP样表型减弱、罕有异常WNT信号激活，这解释了其在锯齿状肿瘤通路中的作用受限。
在结直肠癌的发生发展过程中，有一条被称为“锯齿状通路”的重要途径，它贡献了约25%的病例。这条通路与经典的“腺瘤-癌变”通路不同，通常与BRAF基因的突变紧密相连，表现出明显的分子特征，例如广泛的DNA甲基化改变（即CpG岛甲基化表型，CIMP）。然而，同样是MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路中关键驱动基因的KRAS，其突变在锯齿状肿瘤中却相对少见。一个核心的谜团在于：既然BRAF和KRAS都作用于相同的MAPK通路，且其突变通常相互排斥，为什么由KRAS突变启动的锯齿状肿瘤似乎不具备与BRAF突变肿瘤同等的恶变潜力？KRAS突变体是否缺乏驱动CIMP或激活WNT信号通路（这是肿瘤进展的关键步骤）的能力？为了深入探索这些差异背后的机制，一项研究在小鼠体内对致癌性Braf和Kras突变进行了长期、全面的比较分析，揭示了它们在组织学、转录组学和表观遗传学层面的显著区别，研究结论发表于《British Journal of Cancer》。
为开展此项研究，作者主要采用了以下几种关键技术方法：首先，使用了cre诱导的时间空间特异性转基因小鼠模型（BrafV637E和KrasG12D），与肠道特异性表达的Villin-CreERT2小鼠杂交，通过单次注射他莫昔芬精准激活致癌突变。其次，通过免疫组织化学（IHC）评估β-Catenin（β-连环蛋白）和Ki67蛋白的表达以分析WNT信号和增殖活性。再者，对小鼠肠道组织进行全转录组RNA测序（RNA-Seq）和简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS），以分析基因表达差异和全基因组DNA甲基化变化。最后，利用计算工具（如ImmuneCC）对RNA测序数据进行去卷积分析，以估算和比较不同免疫细胞群的比例。
致癌性Braf和Kras突变诱导不同外显率的小鼠锯齿状肿瘤
研究者发现，长期暴露于致癌性Braf会导致小鼠锯齿状前体病变（mSP）随时间显著累积，并发展为小鼠锯齿状病变（mSL）和侵袭性癌症。相比之下，Kras突变体获得更少的mSP，并且发展为mSL的概率显著更低。此外，Braf突变体在雄性和雌性动物中诱导晚期锯齿状肿瘤的频率相同，而Kras诱导的肿瘤几乎只发生在雄性动物中。
Kras突变诱导的增生较轻，但与Braf突变相比表现出更大的隐窝增殖
尽管Braf突变动物的肠道长度和绒毛长度均显著长于Kras突变动物，表明Braf诱导了更严重的增生，但免疫组化分析显示，在所有时间点，Kras突变动物隐窝中的Ki67阳性细胞比例（即增殖活性）均显著高于Braf突变动物。
WNT信号通路超激活不是Kras突变锯齿状病变的特征
在Kras突变小鼠的mSLs中，仅有1/23的病变观察到异常的β-catenin核定位，显示WNT信号通路异常激活极为罕见。相反，在之前的报告中，Braf突变mSLs在10个月和14个月时分别有40%和100%表现出异常的β-catenin染色。
Braf和Kras突变样本中肠道转录组的时间性差异
RNA测序分析揭示了Braf和Kras突变肠道在2、8、14个月时存在显著的差异基因表达。在多个时间点持续下调的基因富集于免疫相关过程，如免疫反应和先天免疫反应。去卷积分析进一步揭示，与Kras突变小鼠相比，Braf突变小鼠的肠道微环境中巨噬细胞浸润显著更高，并且M1（促炎型）巨噬细胞基因集显著上调，表明Braf突变诱导了肠道的巨噬细胞炎症反应。
肠道Kras突变以CpG岛甲基化表型的减弱为特征
DNA甲基化分析（RRBS）显示，两种突变都诱导了DNA甲基化的积累，但Kras突变肠道在一部分CpG位点（1306个）上表现出更缓慢的甲基化积累速率。主成分分析表明，Braf突变加速了与年龄相关的表观遗传漂变，而Kras突变动物的这种加速现象有所减弱。在14个月时，与Braf突变小鼠相比，Kras突变小鼠中有大量基因的DNA甲基化水平相对较低，这些基因的富集分析显示出与分化、对生长因子的反应、WNT信号、增殖和细胞连接形成相关的通路。
该研究的结论表明，尽管Kras突变也能诱导锯齿状肿瘤，但与Braf突变相比，其潜伏期显著更长，外显率更低。Kras突变肿瘤表现出一种减弱的CIMP样表型，并且很少发展出异常的WNT信号通路激活。转录组和表观基因组分析进一步揭示了这两种突变在免疫信号、增殖动力学和表观遗传调控方面的显著差异。这些发现完善了我们对MAPK通路诱导的肠道肿瘤的理解，阐明了为何Braf突变是锯齿状通路癌症的主要驱动因素，而Kras突变在该通路中罕见且进展缓慢，其关键限制因素可能在于CIMP表型的不足和WNT信号激活的缺失。这些数据为理解不同致癌基因在同一条信号通路中却能导致截然不同的肿瘤生物学行为提供了深刻的见解。
