《MicrobiologyOpen》：Assessment of the Incidence of Vibrio spp. in Shrimp Farms Relative to Water Parameters and Their Molecular Detection in the Southwest Coastal Region of Bangladesh
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本文通过评估孟加拉国西南沿海地区虾养殖场弧菌属发生率与水质参数的关系，并运用分子技术检测弧菌，发现雨季虾样本弧菌数量最高，且除冬季铵态氮外，多数水质参数与弧菌发生率无显著相关性。研究揭示了特定致病基因的分布，为虾养殖场弧菌控制策略提供了科学依据，对水产养殖安全和公共卫生具有重要参考价值。
1 引言
虾是全球广受欢迎的食物之一，孟加拉国亦不例外。随着集约化养殖系统的发展，虾生产面临着来自细菌，尤其是弧菌属的潜在威胁。弧菌属是常见的水生细菌，可作为人类和鱼类的机会致病菌。其中，霍乱弧菌和副溶血弧菌是两种最常见的致病种，能引起败血症、急性胃肠炎和霍乱。多种环境参数，如水温、盐度、pH、浊度、有机物和无机营养盐（如铵态氮、亚硝酸盐+硝酸盐和磷酸盐）以及浮游生物密度、溶解氧和总溶解固体等，已知会影响水生生态系统中弧菌属的发生率和丰度。尽管在孟加拉国已进行多项关于虾和虾产品的研究，但鲜有研究同时评估雨季和冬季虾养殖场中弧菌属发生率与不同水质参数的关系，并进行分子检测。因此，本研究旨在填补这一知识空白。
2 材料与方法
2.1 实验地点
采样地点选在孟加拉国库尔纳和萨特希拉区的四个不同区域，这些地区以拥有众多虾养殖场和对虾及虾养殖的巨大需求而闻名。
2.2 采样
在2024年的雨季（7月30日至8月30日）和冬季（11月30日至12月30日），从30个池塘中，以每周7天为间隔，每个池塘的试验单元随机采集虾、水和沉积物三种类型的样品，每次采样每个样品设3个重复。最终，在雨季和冬季各采集了360个虾样品、360个水样品和360个沉积物样品。
2.3 样品处理
虾样品用无菌3%氯化钠溶液清洗以去除表面微生物、碎屑、沙子和黏液，然后解剖分离鳃、肌肉、肝胰腺和肠道，并制备匀浆液。水样通过离心去除沉积物，沉积物样品制备匀浆悬浮液。
2.4 弧菌属的分离
使用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂平板进行10倍系列稀释和涂布，计算菌落形成单位(CFU)。挑取典型菌落进行纯化培养。
2.5 水质参数分析
在每个采样点即时测定水温。随后在实验室测定水样中的铵态氮、亚硝酸盐、pH、铁含量和盐度，均使用特定试剂盒或仪器（如折射仪）完成。
2.6 弧菌属的分子检测
使用Tianamp细菌DNA试剂盒提取基因组DNA，并通过实时聚合酶链反应(PCR)进行检测。针对霍乱弧菌，靶向物种特异性热休克蛋白(groEL)基因；针对副溶血弧菌，靶向物种特异性毒素调控因子(toxR)基因及其毒力基因耐热直接溶血素(tdh)和耐热相关溶血素(trh)。实时PCR在CFX96系统上进行，40个循环后荧光未增加视为阴性。
2.7 统计分析
计算二项分布的95%置信区间。使用卡方检验解释弧菌存在率的季节性和地域性差异。使用Pearson相关分析和热图评估水质参数对总弧菌数的影响。使用二元逻辑回归分析观察trh基因阳性副溶血弧菌与不同水质参数之间的关系。统计学显著性设定为p值<0.05。
3 结果
3.1 虾、水和沉积物样品中弧菌属的总载量
在采集的样品中，雨季的虾样品显示出最高的平均总弧菌属数量（9.39 ± 0.34 log CFU/mL），而冬季的水样显示最低的平均总弧菌属数量（9.28 ± 0.34 log CFU/mL）。冬季虾样品的平均总弧菌属数量（9.36 ± 0.66 log CFU/mL）略低于雨季的虾样品。
3.2 弧菌属阳性样品的百分比
基于培养、形态和生化特征，在雨季，从1080个样品中共鉴定出285个弧菌属分离株（阳性率26.38%），阳性率从高到低依次为虾（42.5%）、沉积物（19.16%）和水（17.5%）。在冬季，共鉴定出246个弧菌属分离株（阳性率22.77%），阳性率从高到低依次为虾（38.33%）、沉积物（15.83%）和水（14.16%）。
3.3 不同采样点阳性样品的百分比
在雨季，萨特希拉萨达尔采样点的样品弧菌分离率最高（29.16%），冬季也是如此（25.69%）。然而，在两个季节中，不同采样点的样品与弧菌分离率均无显著关联。所有30个池塘在雨季均被标记为受细菌污染，而在冬季，90%（27/30）的池塘呈阳性。
3.4 不同水质参数的水平
雨季水样的平均温度、pH、铵态氮、亚硝酸盐、铁和盐度分别为28.98°C±2.52°C、7.56±1.01、0.17±0.39 mg/L、0.15±0.32 mg/L、2.08±0.66 mg/L和7.49±1.39 ppt。冬季则分别为22.6°C±3.61°C、7.60±1.009、0.13±0.32 mg/L、0.20±0.40 mg/L、2.08±0.64 mg/L和7.58±1.25 ppt。
3.5 弧菌属发生率与水质参数之间的相关性
Pearson相关分析显示，除了冬季铵态氮与弧菌属发生率之间存在显著相关性外，雨季和冬季的所有其他水质参数与弧菌属发生率之间的线性关系均不显著。在雨季，弧菌属发生率与铵态氮、亚硝酸盐和铁呈极弱的正线性关系，但与温度、pH和盐度呈极弱的负线性关系。在冬季，弧菌属发生率与铵态氮呈弱的正线性关系，但与温度、pH、亚硝酸盐、铁和盐度呈极弱的负线性关系。
3.6 霍乱弧菌和副溶血弧菌的分子检测
在雨季和冬季假定的弧菌属分离株（n=531）中，选择177个分离株进行种水平的分子检测。其中，48.02%（85/177）的分离株对霍乱弧菌呈阳性，51.97%（92/177）对副溶血弧菌呈阳性。在92个副溶血弧菌分离株中，14个（15.21%）分离株对trh基因呈阳性（雨季9个，冬季5个），6个（6.52%）分离株对tdh基因呈阳性（雨季5个，冬季1个）。
3.7 trh基因阳性副溶血弧菌发生率与水质参数之间的逻辑回归分析
在雨季，pH值与trh基因阳性副溶血弧菌的发生率呈显著正相关。同时，其发生率与铁、铵态氮和盐度呈正相关，与温度和亚硝酸盐呈负相关。在冬季，其发生率与铁和盐度呈正相关，但与温度、pH、铵态氮和亚硝酸盐呈负相关。除了雨季的pH值外，这些相关性均不显著。
4 讨论
本研究结果支持了弧菌属在温暖季节更普遍的观察。雨季较高的弧菌分离率可能与该季节较温暖的水温有关。测得的水质参数，如碱性pH（~7.6）和适中盐度（~7.5 ppt），处于弧菌属生长的典型适宜范围。记录的铵态氮和亚硝酸盐水平被认为对虾无毒，且可能支持弧菌生长。
然而，相关分析表明，除了冬季铵态氮与弧菌总数之间存在弱正相关外，水质参数与弧菌总发生率之间缺乏显著关联，这与一些先前的研究结果一致。这种非显著关联可能表明，这些参数在所研究的范围内并非弧菌存在的主要限制因素，或者其他未测量的环境因素（如溶解有机物、浮游生物动态）发挥着更重要的作用。
分子检测结果显示，弧菌属分离株中，副溶血弧菌（51.97%）略高于霍乱弧菌（48.02%）。此外，在副溶血弧菌中检测到了重要的毒力基因trh（15.21%）和tdh（6.52%），这预示着这些分离株可能具有潜在的致病性。研究发现，除了雨季pH值与trh阳性菌存在显著正相关外，水质参数与这些毒力基因的存在之间没有明确的模式。
5 结论
本研究强调了评估两个不同季节虾养殖场中弧菌属发生率与水质参数关系的重要性。雨季虾样品的弧菌平均总数最高，而冬季水样品的弧菌平均总数最低。雨季的弧菌分离率高于冬季。除冬季铵态氮外，两个季节中水质参数与弧菌属发生率均无显著关系。此外，大部分弧菌属分离株为副溶血弧菌阳性，且除雨季pH值外，水质参数与trh基因阳性副溶血弧菌发生率之间均无显著关系。这些发现为未来在孟加拉国乃至全球虾养殖区，评估弧菌属数量随时间变化与水质参数变化的关系提供了必要的指导。更重要的是，本研究强烈建议实施定期监测计划，以确认和区分弧菌属的致病菌株，这最终将有助于制定建设性的管理计划，以抑制弧菌病在虾养殖场的传播风险。
