一种基于离子液体的快速DNA提取方法用于尿路感染的分子诊断

《Microbiology Spectrum》：A rapid ionic liquid-based DNA extraction method for molecular diagnostics of urinary tract infections

　　

从尿液中快速可靠地提取DNA是推动尿路感染（Urinary Tract Infections，UTIs）分子诊断（无论是集中式还是分散式场景）的关键瓶颈。本研究提出了一种基于离子液体的DNA提取方法（Ionic Liquid-based DNA Extraction，IL-DEx），可在30分钟内从尿液样本中回收细菌DNA，仅需最少设备且不依赖危险化学品。研究人员将IL-DEx与广泛使用的商业化试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，QIAGEN）进行了基准比对，测试对象涵盖参考菌株、临床分离株及加标尿液样本。针对革兰阴性菌，IL-DEx获得的DNA产量与对照相当（相对提取效率47%–102%）；针对革兰阳性菌，其回收率较低（0.7%–8%），但仍足以支持下游检测。定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）结果显示，该方法在108–102CFU/mL浓度范围内呈线性DNA回收（R2 > 0.99），使用1 mL尿液时，革兰阴性菌检测限约为102–103CFU/mL，革兰阳性菌约为103–104CFU/mL。对13份患者尿液样本（10份培养阳性，3份培养阴性）的临床评估表明，IL-DEx可通过qPCR和全长16S rRNA基因测序（Oxford Nanopore）可靠实现病原体检测，性能与同期比对的三种其他方法（QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit、Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit及酚-氯仿提取法）相当。这些发现确立了IL-DEx作为首个经评估可用于临床尿液样本DNA回收的离子液体方法，提供了一种快速、简便、低成本的技术路径，可整合至多种实验室和临床场景下的尿路感染分子诊断流程中。

尿路感染是全球最常见的感染性疾病之一，每年影响超过4亿人，是女性、老年人、孕妇、导管留置患者及糖尿病患者的常见健康负担。传统诊断依赖尿培养，需要18–30小时完成菌种鉴定，再加18–24小时药敏试验，且灵敏度有限，难以检测苛养菌及混合感染。分子诊断技术可将病原体鉴定时间缩短至数小时，但上游DNA提取步骤往往成为制约其推广的瓶颈——现有方法多操作繁琐、成本高或依赖危险有机试剂，难以适配快速、分散化的检测场景。在此背景下，研究人员开发了一种基于离子液体的DNA提取方法IL-DEx，旨在解决尿液样本（含复杂基质、宿主DNA背景及抑制物）的快速核酸制备难题，以支持尿路感染的即时分子诊断。

研究采用的主要关键技术方法包括：使用涵盖7种常见尿路致病菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、腐生葡萄球菌）的参考菌株与临床分离株进行提取效率验证；设计人工尿液与健康供体尿液的加标实验，结合qPCR评估线性范围与检测限；纳入13例临床尿液样本（10例培养阳性、3例培养阴性）进行多方法头对头比较，对照方法包括QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit、Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit及酚-氯仿提取法；通过qPCR定量16S rRNA、23S rRNA及人Alu重复序列，结合Oxford Nanopore全长16S rRNA基因测序进行微生物谱解析。

IL-DEx工作流程

该方法整合化学裂解与磁珠纯化，使用1-乙基-3-甲基咪唑乙酸酯（[C₂mim][OAc]）同时实现细菌裂解与核酸结合，全过程在30分钟内完成，仅需离心机、加热块与磁架，无需有机溶剂。

DNA回收自细菌参考菌株和临床分离株

在纯培养体系中，革兰阴性菌的相对提取效率为47%–102%，与商业化试剂盒相当；革兰阳性菌效率为0.7%–8%，受厚细胞壁抗裂解特性影响，但仍可获得约10⁷拷贝的16S rRNA基因，满足下游检测需求，且临床分离株表现略优于参考菌株。

DNA回收自加标尿液样本

在人工尿液中，IL-DEx在10⁸–10²CFU/mL范围内呈线性回收（R2 > 0.99），革兰阴性菌检测限约10³CFU/mL，革兰阳性菌约10⁴CFU/mL；改用物种特异性23S rRNA qPCR后，大肠杆菌检测限降至10²CFU/mL。健康供体尿液加标实验中，IL-DEx与QIAGEN的回收量无统计学差异，仅在未加标女性尿液中因阴道菌群含较多革兰阳性菌而出现轻微偏低。

DNA回收自临床尿液样本

在13例临床样本中，IL-DEx获得的总核酸与总DNA产量与QIAGEN及酚-氯仿法无显著差异，低于Promega MagaZorb试剂盒。其A260/280纯度符合标准，A260/230略低，且DNA完整性优于Promega与酚-氯仿法。细菌DNA回收量与显微镜下的菌体负荷一致，在培养阳性样本中，IL-DEx与Promega及酚-氯仿法的差异主要体现在定量层面，不影响病原体检出。大肠杆菌特异性qPCR结果与培养状态显著相关。全长16S测序显示，IL-DEx可在多数样本中检出优势病原体（相对丰度≥75%），并能检测到低丰度的革兰阳性菌，仅在一例极低生物量样本中出现与其他方法不一致的菌群组成，推测为低载量下的随机扩增效应。

讨论与结论

IL-DEx在革兰阴性菌提取性能上与QIAGEN相当，对革兰阳性菌的回收虽偏低但不影响检测，优势在于速度快、成本低（约2欧元/样）、无需危险试剂，适合集中与分散式实验室。Promega与酚-氯仿法产量更高但DNA片段化程度较重或操作复杂。研究的局限性包括临床样本量较小、尚未评估在等温扩增与鸟枪法宏基因组中的应用、未覆盖真菌病原体。总体而言，IL-DEx是一种快速、简便、经济的尿液DNA提取方案，可整合至下一代尿路感染分子诊断流程，有望缩短检测周期、减少经验性抗生素使用，并提升基层医疗机构的诊断可及性。该论文发表于《Microbiology Spectrum》。