基于TiO2NR @ AgNPs芯片与多功能SERS微球的病毒基因传感检测方法

《Applied Surface Science Advances》：Virus gene sensing detection method based on TiO 2NR @ AgNPs chip and the multifunctional SERS microspheres

　　

表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）已迅速发展为一种用于检测水溶液中痕量病毒基因靶标的强有力且不可或缺的工具。然而，SERS性能受限于聚焦区域内热点（hotspot）密度及分析物浓度，从而损害检测重复性。本研究提出一种新型SERS策略，将TiO₂NR @ AgNPs芯片与多功能SERS微球协同集成。该多功能SERS微球能够在水溶液中选择性富集目标生物分子。此外，利用铷磁体将这些微球富集并锚定于TiO₂NR @ AgNPs芯片表面，可在接触区域形成稳定且致密堆积的热点。最终，该策略被应用于水溶液中呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）基因的免疫捕获与检测。计算结果表明，该策略获得的SERS增强因子（Enhancement factors，EFs）为1.14 × 10⁷。尤其是，该方法对RSV基因的检测限达到<1 pM，突显出其卓越灵敏度。因此，该策略有望提升异质、复杂及动态生物水溶液环境中病毒基因的检测能力。

该论文发表于《Applied Surface Science Advances》，聚焦于复杂水相环境中痕量病毒基因的高灵敏检测问题，核心目标是提升表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）在生物分子检测中的稳定性、重复性与检测下限。研究背景在于，呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是婴幼儿严重呼吸系统疾病的重要病原体之一，其临床表现与流感及其他呼吸道疾病高度相似，容易造成误诊并延误治疗。现有病毒分型与检测手段中，全基因组测序虽为金标准，但对样本浓度、纯度、操作人员能力及实验条件要求较高，难以在基层场景广泛推广；聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）及其衍生技术应用广泛，但依赖核酸特异性扩增，增加了检测成本。尽管已有电化学、荧光和生物传感等快速检测技术被提出，但总体准确性仍难以全面达到PCR及其衍生方法水平。因此，开发一种无需复杂扩增、可在水溶液中实现痕量病原微生物基因快速检测的新策略，成为感染性疾病防控领域的重要课题。

在这一背景下，研究人员从SERS检测的关键瓶颈出发开展研究。既往研究指出，SERS信号增强主要来源于局域电磁“热点”，而传统SERS检测在水相环境中往往受限于激光焦区内热点密度不足以及分析物浓度偏低，导致信号重复性差。为改善这一问题，已有研究尝试将SERS与免疫微球结合，使球形多功能基底同时具备富集和增强能力，但微球在水溶液中持续受到布朗运动影响，难以稳定调控纳米尺度颗粒间距与金属纳米结构空间分布，也就难以精确控制热点出现的概率、位置和强度，从而限制了实际应用。针对这些不足，本文提出将铷磁体驱动的磁性多功能SERS微球富集策略与TiO₂NR @ AgNPs芯片结合，通过磁吸附使微球稳定锚定在芯片表面，在接触界面构建稳定且高密度的新纳米间隙等离激元（gap plasmons）热点，从而实现对病毒基因的高效富集与高灵敏拉曼检测。

作者为实现该研究主要采用了以下关键技术方法：首先，通过磁控溅射、水热法和激光沉积相结合制备TiO₂NR @ AgNPs芯片；其次，以Fe₃O₄为磁核、SiO₂为壳层并负载AgNPs，进一步经链霉亲和素（streptavidin，SA）和生物素化探针DNA构建多功能SERS微球；随后，在含tRSV-DNA及其他病毒DNA的多组分溶液中进行杂交捕获，并借助铷磁体实现磁分离与界面富集；最后，结合COMSOL Multiphysics电磁仿真、电子显微镜（EM）、能谱（EDS）、原子力显微镜（AFM）、双光子显微镜（TPM）以及共聚焦拉曼检测和二维相关分析，对结构特征和检测性能进行系统评估。

3.1. COMSOL simulation analysis
研究人员首先利用COMSOL Multiphysics开展电磁仿真，分析TiO₂NR @ AgNPs芯片与多功能SERS微球在局域电场增强中的各自作用。结果显示，银纳米球（AgNPs）的表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）模式随粒径而变化：直径50–60 nm时以偶极共振为主，增至70–80 nm时逐渐转为高阶四极共振模式；在532 nm激发波长下，粒径由50 nm增至80 nm时吸收强度单调增强。进一步仿真表明，多功能SERS微球与TiO₂NR芯片结合时，局域电场增强主要来自微球表面AgNPs纳米结构，而TiO₂NR芯片本身对电场增强贡献较弱，此时局域电场增强因子（E/E₀）约为32，对应拉曼EFs约10⁵。相比之下，二氧化硅微球与TiO₂NR@AgNPs芯片结合时，增强能力主要来自芯片，局域电场增强因子约46，拉曼EFs约4.4 × 10⁶。当多功能SERS微球与TiO₂NR@AgNPs芯片协同作用时，接触界面产生致密的新间隙等离激元，进一步强化局域光场，理论上可实现约7.8 × 10⁶的拉曼EFs。该部分结果说明，论文提出的耦合策略具有明确的电磁增强基础，其优势在于界面新生热点的构建。

3.2. Characterization of TiO₂NR @ AgNPs chips and the multifunctional SERS microspheres
在结构表征部分，研究人员采用电子显微镜、AFM和TPM对TiO₂NR @ AgNPs芯片及多功能SERS微球的中间产物和终产物进行了系统验证。TiO₂NR芯片顶视SEM图像显示，TiO₂纳米棒在FTO玻璃基底上致密生长，AFM测得纳米棒宽度约100 nm；侧视图进一步证实FTO玻璃作为支撑基底，EDS结果给出了TiO₂纳米棒中氧、钛元素的质量百分比和原子百分比。AFM高度分析显示，水热生长后TiO₂NR结构平均高度约1.5 μm。随后，经375 nm激光照射30 min后，AgNPs均匀包覆于TiO₂纳米棒表面，芯片颜色由白色转为黄褐色，证实TiO₂NR @ AgNPs芯片成功制备，EDS亦检测到银元素存在。用于微球表面的AgNPs由Lee-Meisel法制备，电镜显示颗粒尺寸较均一，直径约80 nm。为验证RSV-pDNA与微球表面的偶联，作者引入6-羧基荧光素标记，在480 nm激发下于约532 nm发射绿色荧光，双光子共聚焦荧光显微图像显示微球成功发出绿色荧光，证明探针分子已成功连接至微球表面。最后，界面形貌电镜图显示，微球在磁力作用下牢固吸附于芯片表面，二者表面的纳米结构形成新的界面纳米间隙，为后续SERS信号增强提供了形貌学依据。

3.3. Raman spectrum analysis
在性能验证中，研究人员选取RSV特征基因为目标分析物，并将其与其他病毒遗传物质共同配制成浓度范围为1 μM至1 pM的多组分测试溶液。所得SERS谱图中，600 cm^?1处为TiO₂峰，952 cm^?1归属于脱氧核糖的CO和CC振动，1172 cm^?1对应鸟嘌呤（guanine，G）特征峰，1239 cm^?1对应链霉亲和素的酰胺Ⅲ/β-折叠峰，1303 cm^?1为胞嘧啶（cytosine，C）特征峰，1379 cm^?1对应胸腺嘧啶（thymine，T）、腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（G）的环呼吸模式，1553 cm^?1为链霉亲和素中色氨酸相关峰，1603 cm^?1为T的典型拉曼模式，1695 cm^?1则被视为杂交光谱标志。随着分析物浓度升高，多个特征峰强度均明显增大。为建立浓度与谱峰响应之间的定量关联，作者进一步使用二维相关分析处理7组谱线，构建同步二维相关谱。结果显示，1553 cm^?1与tRSV-DNA浓度变化的相关性最强，因此被选定为定量分析特征峰。基于1553 cm^?1处信号建立的拟合关系中，决定系数r²为0.98，说明该检测体系具有较好的浓度响应线性。

随后，研究人员比较了四种检测策略的增强性能，即普通免疫微球+TiO₂NR芯片、 多功能SERS微球+TiO₂NR芯片、普通免疫微球+TiO₂NR@AgNPs芯片，以及本文提出的多功能SERS微球+TiO₂NR@AgNPs芯片。普通免疫微球与TiO₂NR芯片策略被视为非增强拉曼检测，对100 μM tRSV-DNA在1553 cm^?1处的信号强度为113.71。采用多功能SERS微球+TiO₂NR芯片时，0.1 nM tRSV-DNA在1553 cm^?1处的SERS强度为427.89，对应EFs为3.76 × 10⁶。采用普通免疫微球+TiO₂NR@AgNPs芯片时，同浓度下1553 cm^?1处强度为951.46，对应EFs为8.37 × 10⁶。而在本文提出的耦合增强策略中，多功能SERS微球与TiO₂NR @ AgNPs芯片共同作用下，0.1 nM tRSV-DNA的SERS信号进一步提高，测得增强因子达到1.14 × 10⁷，检测限低于1 pM。该结果说明，与单独依赖微球增强或芯片增强相比，界面耦合构建的高密度稳定热点能够显著放大拉曼响应，并提升痕量病毒基因检测能力。

综合讨论部分可见，该研究围绕水相环境下SERS检测中“热点不稳定、密度不足、重复性受限”的关键问题，提出了磁性微球富集与纳米芯片界面耦合相结合的解决方案。文章的主要贡献并非单一材料性能优化，而是在检测体系层面实现了“选择性捕获—磁性富集—界面锚定—热点重构—信号放大”的连续过程，从而兼顾了目标分子的特异性富集与SERS热点的稳定生成。仿真、形貌表征与光谱数据相互印证：AgNPs粒径、芯片纳米棒结构、微球表面金属纳米层以及磁力驱动的接触界面，均共同决定了最终增强效果。研究结果表明，该策略适用于异质、复杂、动态生物水溶液中的病毒基因检测，尤其在痕量分析方面展现出较高潜力。

研究结论部分可译为：本文将多功能SERS微球与TiO₂NR@AgNPs芯片结合，提出了一种用于水溶液中痕量病毒基因检测的新型SERS策略。以TiO₂NR@AgNPs芯片作为增强基底，并结合铷磁体吸附多功能SERS微球，在二者接触区域形成间隙等离激元，以增强目标分子的SERS信号。最终，研究人员对多组分溶液中不同浓度的tRSV-DNA分子进行了SERS检测。结果表明，该策略的检测限为1 pM。研究还证实，特征峰信号强度与溶液中RSV浓度之间具有较强相关性。总体而言，该策略能够在极低浓度条件下稳定实现水溶液中特异性生物大分子的SERS检测，并为未来相关研究提供了重要启示。