双受体敲除CAR-T细胞阻断前列腺素E2信号增强实体瘤疗效

《Nature Biomedical Engineering》：Ablation of prostaglandin E2 signalling through dual receptor knockout in CAR T cells enhances therapeutic efficacy in solid tumours

为解决前列腺素E2在实体瘤微环境中抑制CAR T细胞功能这一难题，本研究采用CRISPR-Cas9技术敲除其受体EP2和EP4。结果显示，改造后的CAR T细胞在PGE2富集环境中增殖不受影响，在多种小鼠模型及患者来源类器官中展现出更强的抗肿瘤活性。这为提升CAR T疗法在实体瘤中的疗效提供了新策略。

　　

在对抗癌症的“免疫战争”中，嵌合抗原受体T细胞疗法无疑是一颗闪耀的明星，它通过改造患者自身的T细胞，使其能精准识别并攻击肿瘤细胞，已在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性的成功。然而，当面对乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌等实体瘤时，这支精锐部队却常常遭遇“滑铁卢”。实体瘤的微环境是一个复杂而险恶的战场，其中充满了各式各样的“烟雾弹”和“路障”，严重抑制了CAR T细胞的功能和持久性。其中，一种名为前列腺素E₂的脂质分子，扮演了关键“反派”角色。它由肿瘤细胞和微环境中的其他细胞大量产生，通过结合T细胞表面的受体，如EP2和EP4，发出抑制信号，严重阻碍了CAR T细胞的扩增和生存，导致其“兵力”在肿瘤内部不断衰减，最终治疗失败。

那么，能否给CAR T细胞穿上“防弹衣”，使其免受PGE₂的“火力压制”？这正是发表在《自然-生物医学工程》上的这项研究要回答的核心问题。研究人员提出一个大胆设想：利用基因编辑技术，将CAR T细胞上接收PGE₂抑制信号的“天线”——EP2和EP4受体同时敲除，从而让这些治疗性细胞在PGE₂弥漫的肿瘤微环境中也能畅行无阻，发挥强大的抗肿瘤功能。

为了验证这一设想，研究团队巧妙地将基因编辑整合到CAR T细胞的制备流程中。他们采用了CRISPR-Cas9技术，在CAR T细胞转导后，同时敲除其编码EP2和EP4受体的基因。由于这些受体蛋白难以通过常规的流式细胞术或蛋白印迹直接检测，研究团队创造性地通过监测PGE₂刺激后细胞内环磷酸腺苷水平以及下游信号蛋白CREB的磷酸化水平，来间接但功能性地验证受体敲除的效率。体外研究中，他们使用了小鼠和人的多种CAR T细胞模型（例如靶向EpCAM、HER2、MSLN的CAR T细胞）与相应的肿瘤细胞系共培养。体内研究则更为全面，涵盖了同源小鼠肿瘤模型（如D4M.3A-SIINFEKL黑色素瘤）、人源肿瘤异种移植模型（如BxPC3胰腺癌、Msto-hMSLN间皮瘤），并利用患者来源的器官型肿瘤球体模型，测试了改造后CAR T细胞对抗胰腺导管腺癌、结直肠癌和神经内分泌肿瘤患者样本的效果。

研究人员发现，同时敲除EP2和EP4受体，而不仅仅是单个受体，是抵抗PGE₂抑制所必需的。在体外，当暴露于高浓度PGE₂时，未经改造的CAR T细胞扩增受阻、存活率下降，导致其杀伤肿瘤细胞的能力大幅减弱。而EP2^?/?EP4^?/?双敲除的CAR T细胞则完全不受影响，其增殖和杀伤能力得以保全。有趣的是，PGE₂主要影响的是CAR T细胞的“数量”（即增殖和存活），而非其“质量”（即单细胞水平的激活和细胞因子产生能力）。

在体外的功能验证基础上，研究证明了EP2^?/?EP4^?/?CAR T细胞在多种体内模型中也表现出更优的抗肿瘤效果。在携带D4M.3A-SIINFEKL黑色素瘤的小鼠中，接受双敲除OT-I T细胞（一种模型T细胞）治疗的小鼠肿瘤生长更慢，部分达到完全缓解。在BxPC3胰腺癌和Msto-hMSLN间皮瘤的人源肿瘤异种移植小鼠模型中，EP2^?/?EP4^?/?的CAR T细胞同样显著延缓了肿瘤生长，甚至在一些小鼠中清除了肿瘤，并延长了其生存期。更令人鼓舞的是，在临床相关度极高的患者来源的器官型肿瘤球体实验中，双敲除的抗HER1 CAR T细胞对结直肠癌、胰腺导管腺癌和神经内分泌肿瘤样本的杀伤效果也优于对照CAR T细胞。

EP2^?/?EP4^?/?CAR T细胞疗效提升的关键机制在于其在肿瘤微环境中的持久性增强。通过活体成像和肿瘤组织流式分析，研究人员发现，双敲除的CAR T细胞在肿瘤内的扩增和积累明显多于对照细胞。正是这种“兵力”上的优势，而非细胞本身“战斗力”的增强，最终转化为更好的肿瘤控制效果。

在讨论部分，研究者强调了这项工作的临床转化潜力。传统的系统性抑制PGE₂合成（如使用COX-2抑制剂）因严重的副作用而应用受限。相比之下，通过基因编辑选择性“屏蔽”CAR T细胞对PGE₂的感知，是一种更加精准、副作用可能更小的策略。本研究首次成功实现了对两个难以直接检测的G蛋白偶联受体的双重敲除，并建立了一套功能性验证敲除效率的方法，为靶向更多“难治”但重要的免疫调节受体铺平了道路。尽管多重基因编辑可能带来安全性的考量，但初步的脱靶分析未发现明显的非预期编辑，且研究者认为，考虑到CAR T疗法在实体瘤中的迫切需求和巨大挑战，这种策略带来的潜在获益值得深入探索。

综上所述，这项研究不仅揭示了PGE₂-EP2/EP4轴是实体瘤微环境中抑制CAR T细胞功能的一个关键瓶颈，更重要的是，它提供了一种创新的工程化解决方案。通过CRISPR-Cas9技术同时敲除EP2和EP4受体，可以为CAR T细胞在恶劣的肿瘤微环境中“保驾护航”，显著增强其扩增、持久性和抗肿瘤效力。这一发现为克服实体瘤对CAR T疗法的抵抗，开发下一代更强大的癌症免疫疗法指明了新的方向。