《Developmental & Comparative Immunology》：CRISPR-based functional analysis of chicken
IRF9 reveals distinct modulation of dsRNA stimulated innate immune pathways
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本研究针对因鸡免疫基因库缩减而对其先天抗病毒免疫机制理解有限的问题，利用CRISPRi/a技术平台，探讨了新注释的鸡IRF9基因在I型干扰素（IFN-I）应答中的功能。研究发现，鸡IRF9的转录抑制能改变RIG-I样受体及Toll样受体等先天免疫通路，且其过表达无法在IRF7被抑制时挽救下游干扰素刺激基因（ISG）的表达，暗示其功能与经典的哺乳动物IRF9不同，为基于功能证据的禽类IRF分类提供了新见解。
近年来，高致病性禽流感（HPAI）尤其是H5N1毒株的持续暴发，对美国乃至全球的家禽业构成了巨大威胁。自2022年首次暴发以来，已影响了全美50个州的超过1.68亿只家禽。这一现状凸显了仅依靠生物安全措施不足以有效防控疾病，迫切需要开发更有效的治疗和疫苗策略。然而，一个关键障碍在于我们对鸡免疫系统的理解仍然有限，特别是对其先天抗病毒免疫应答和I型干扰素（Interferon, IFN）反应背后的分子机制知之甚少。
在哺乳动物中，I型干扰素反应主要由干扰素调节因子（Interferon Regulatory Factors, IRF）家族调控，其中IRF9是一个核心的转录调节因子。它能与STAT1、STAT2形成干扰素刺激基因因子3（Interferon-stimulated gene factor 3, ISGF3）复合体，进入细胞核激活数百个干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs），从而建立抗病毒状态。但长期以来，IRF9被认为在鸡基因组中缺失。直到最新的鸡参考基因组注释（bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b）中，才列出了一个推定的鸡IRF9基因。这个基因到底是不是真正的IRF9？它在鸡的免疫防御中扮演什么角色？是与哺乳动物中的“正牌”IRF9功能一致，还是另有所职？这些问题都悬而未决。鉴于鸡与哺乳动物免疫系统存在显著差异，其免疫基因库相对缩减（例如，关键的免疫调节因子IRF3和RIG-I在鸡中也被认为缺失），简单地将哺乳动物的知识套用在鸡身上是危险的。因此，对鸡IRF9进行功能验证，对于理解禽类独特的免疫机制、应对禽流感等疾病至关重要。
为了揭开鸡IRF9的神秘面纱，来自宾夕法尼亚州立大学的研究团队在《Developmental 》上发表了一项研究。他们巧妙地运用了前沿的CRISPR基因调控技术，扮演了一次细胞内的“基因音量调节师”，对鸡IRF9进行精准的“调低”和“调高”，并结合转录组学分析，深入探究了其在双链RNA（dsRNA）模拟病毒感染刺激下的先天免疫应答中的功能。
研究者主要运用了几项关键技术：首先，他们利用CRISPR抑制（CRISPRi）系统，构建了稳定表达dCas9-KRAB融合蛋白的鸡胚成纤维细胞（DF-1）系，实现了对IRF9基因转录的内源性靶向抑制。其次，他们采用了CRISPR激活（CRISPRa）与抑制（CRISPRi）的双系统，在同一个细胞中同时实现一个基因的激活和另一个基因的抑制，用于研究基因间的相互作用（上位性分析）。研究的核心样本是经过工程化改造的DF-1细胞系。最后，对经过不同处理的细胞进行双链RNA（poly(I:C)）刺激以模拟病毒感染，并在多个时间点（0、0.5、1、6小时）收集样本，通过高通量RNA测序（RNA-seq）和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）来全面分析基因表达的变化。数据分析则运用了基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）来挖掘通路水平的变化。
3.1. 预测性蛋白折叠和氨基酸比对显示chIRF9具有IRF特征
研究人员首先通过AlphaFold3预测了鸡IRF9的蛋白质结构，发现其具有两个明显的结构域，符合IRF蛋白特征。进一步的氨基酸序列比对显示，鸡IRF9的DNA结合域（DBD）和蛋白质相互作用域（PID）与其他物种的IRF9/IRF10序列具有保守性。有趣的是，鸡IRF9与爪蟾和斑马鱼的IRF10相似度最高，而非其他物种的IRF9。这从序列上暗示了鸡IRF9可能更接近IRF10家族。
3.2. dCas9-KRAB细胞系整合成功并有效抑制IRF9
研究团队成功开发了稳定表达dCas9-KRAB的DF-1细胞系，并通过PCR和测序确认了该序列整合到了组成型表达的GAPDH基因位点。他们设计了9个靶向IRF9转录起始位点不同位置的引导RNA（gRNA），并鉴定出gRNA 3和5能最有效地抑制IRF9表达，抑制效率最高可达63%，为后续功能研究建立了有效的平台。IRF9的抑制效率。(A) 靶向GAPDH基因3‘端的插入载体示意图。(B) PCR确认dCas9-KRAB插入的左右同源臂。(C) 九个靶向鸡IRF9转录起始位点不同位置gRNA的示意图。(D) 使用不同gRNA后鸡IRF9表达的相对变化。">
3.3. IRF9的转录抑制改变了细胞对dsRNA刺激的通路水平响应
在利用CRISPRi抑制IRF9后，用dsRNA刺激细胞并分析转录组。虽然单个差异表达基因数量有限，但通过GSEA分析在通路水平上发现了显著变化。在未受刺激时（0小时），IRF9敲低导致RIG-I样受体信号通路和Toll样受体信号通路显著富集。此外，核糖体通路在多个时间点呈现负富集，直到6小时后才转为正富集。这表明IRF9的缺失可能影响了细胞的基础免疫监视状态和代谢平衡。IRF9抑制导致的KEGG通路富集分析。(A) 各时间点最富集的KEGG通路及其归一化富集分数点图。(B-D) 关键通路的GSEA图：核糖体通路、RIG-I样受体信号通路、Toll样受体信号通路。">
3.4. IRF9敲低揭示了dsRNA刺激后免疫基因表达的独特时间模式
对比0到6小时dsRNA刺激后的基因表达变化，Mock（对照）和IRF9敲低组共有213个共同的差异表达基因，但也分别有164个和79个独特的差异基因。对共同差异基因的分析显示，它们富集在类固醇生物合成、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路和甲型流感通路等。对23个先天抗病毒免疫相关基因的动力学分析发现，细胞因子信号抑制物SOCS1和SOCS3在IRF9敲低组的表达在6小时时更高，而主要组织相容性复合体II类反式激活因子CIITA的表达则更低。这些变化提示IRF9可能参与免疫负反馈调节以及先天免疫向适应性免疫的过渡。IRF9敲低细胞中免疫基因的时间分析。(A) Mock和IRF9KD细胞在dsRNA刺激后0至6小时的差异表达基因。(B) 6小时时Mock和IRF9KD组差异基因的韦恩图。(C) 三组差异基因富集的KEGG通路。(D) 23个先天抗病毒免疫基因在Mock和IRF9KD组中表达模式的热图。">
3.5. 单独过表达IRF9无法挽救I型干扰素反应
为了测试IRF9能否在I型干扰素通路被阻断时“力挽狂澜”，研究者使用了双CRISPRa/i系统，在同一个细胞中同时抑制I型干扰素的主调控因子IRF7（CRISPRi）并激活IRF9（CRISPRa）。实验成功实现了IRF7的显著抑制（74%）和IRF9的显著激活（110%）。然而，尽管IRF9被过表达，下游的两个典型干扰素刺激基因MX1和PKR的表达依然被显著抑制，未能得到挽救。这一关键实验结果表明，在鸡的I型干扰素通路中，IRF9的单独过表达不足以绕开上游IRF7的调控来启动下游应答。IRF9的上位性分析。(A) IRF7抑制和IRF9过表达的相对变化。(B) 下游MX1和PKR基因的表达情况。">
本研究通过一系列实验得出核心结论：鸡的IRF9在先天免疫应答中扮演着与经典哺乳动物IRF9不同的调控角色。首先，序列分析表明鸡IRF9在进化上更接近于其他物种的IRF10。功能上，在静息状态下抑制IRF9，反而导致RIG-I样受体和Toll样受体这两个关键的病原体识别通路被激活，这出乎意料，因为哺乳动物中IRF9通常正调控这些通路的下游。其次，在动态应答中，IRF9的缺失影响了如SOCS1/3（负反馈调节因子）和CIITA（连接先天与适应性免疫）等基因的表达模式，暗示其可能参与免疫应答的晚期调节和负向调控。最有力的证据来自上位性分析：当过表达IRF9时，无法挽救因IRF7缺失而导致的下游干扰素刺激基因表达抑制，这与哺乳动物中ISGF3复合体功能的经典认知相悖。综合这些发现，研究指出，不能仅依据基因注释和命名来推断其在鸡中的功能，鸡IRF9可能并非经典ISGF3复合体的核心正调控元件，而可能具有更复杂或独特的免疫调节功能，或许更类似于IRF10在某些鱼类中表现的负调控或晚期调控角色。
这项研究的重要意义在于：它首次利用CRISPRi/a这一精细的转录调控工具，在鸡细胞中对新注释的IRF9进行了深入的功能解析，为理解禽类独特的I型干扰素信号网络提供了崭新的视角。研究结果挑战了基于哺乳动物模型的外推假设，强调了跨物种进行功能性基因验证的必要性。这不仅深化了我们对鸟类基础免疫学的认识，也为未来针对高致病性禽流感等禽类重大疫病，开发基于宿主靶点的新型抗病毒策略或免疫增强剂奠定了重要的理论基础。同时，研究中所建立和优化的CRISPR转录调控平台，也为禽类功能基因组学研究提供了强有力的技术手段。
