Runx蛋白末端酪氨酸磷酸化控制辅助性CD4+T细胞与细胞毒性CD8+T细胞谱系选择的机制

《Nature Immunology》：Phosphorylation of Runx protein controls helper CD4+ T cell versus cytotoxic CD8+ T cell lineage choice

T细胞谱系命运决定是免疫学的一个核心科学问题。本研究聚焦于MHC-I和MHC-II选择的胸腺细胞分化为CD8+细胞毒性或CD4+辅助性T细胞的分子开关。研究人员通过基因工程小鼠模型和生物化学分析，揭示了Runx转录因子家族蛋白（Runx1/Runx3）C末端保守的WRPY基序末端酪氨酸（Y）的差异磷酸化状态，是连接TCR信号与谱系特异性基因沉默（特别是Cd4和Thpok基因）的关键环节。研究发现，在MHC-I信号的CD8+T细胞中，该酪氨酸残基的磷酸化增强，促进了Runx蛋白与转录共抑制因子TLE的相互作用，从而特异性沉默辅助性谱系基因，驱动了细胞毒性T细胞分化。这项工作阐明了TCR-MHC信号如何通过转录因子的翻译后修饰精确调控T细胞命运的生化桥梁，具有重要的理论意义。

　　

在胸腺这个“免疫军校”中，刚刚产生的、功能未定的双阳性（CD4⁺CD8⁺）T细胞前体，需要经历一场决定命运的“毕业考试”。这场考试的核心是T细胞受体（TCR）识别由自身主要组织相容性复合物（MHC）分子呈递的抗原肽。根据识别的是MHC-I类分子还是MHC-II类分子，这些前体细胞将分化为截然不同的两种“兵种”：一种是主要杀伤受感染细胞或癌细胞的细胞毒性CD8⁺T细胞，另一种是负责协调免疫应答的辅助性CD4⁺T细胞。这个“MHC限制性”与谱系选择的完美对应是适应性免疫系统的基石，但其背后的分子“翻译官”是如何将细胞膜外的MHC信号，转译成细胞核内截然不同的基因表达程序的，长期以来是一个悬而未决的谜题。

此前的研究已知，谱系选择的关键在于两个关键基因Cd4和Zbtb7b（编码Thpok蛋白）的命运。Cd4编码辅助性T细胞的表面标志物，而Zbtb7b则是驱动辅助性谱系命运的主调控转录因子。在分化为细胞毒性CD8⁺T细胞的过程中，这两个基因必须被严格关闭，这依赖于位于它们基因座位中的转录沉默子（silencer）发挥作用。有趣的是，这两个沉默子都包含Runx转录因子家族的结合位点，且Runx蛋白的结合对于沉默子的激活至关重要。Runx蛋白与共抑制因子TLE（Transducin-like enhancer）家族的相互作用，被认为是执行基因沉默功能的关键。然而，一个核心矛盾出现了：胸腺细胞前体主要表达Runx1蛋白，而Runx1在MHC-I和MHC-II信号通路中都被需要。那么，MHC-I特异性信号究竟是如何特异性地“启动”Runx-TLE这个共抑制复合物，从而只在CD8谱系中沉默Cd4和Thpok的呢？是什么赋予了Runx蛋白这种“双面”功能——既能作为激活子（如在CD8基因表达中），又能作为抑制子？T细胞受体（TCR）信号是如何与这种调控机制连接起来的？为了解决这些问题，Taniuchi研究团队展开了一项深入的研究，并在《Nature Immunology》上发表了他们的发现。

研究人员在本研究中综合运用了多种前沿技术。他们首先通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了一系列内源性Runx1和Runx3蛋白C末端WRPY基序发生点突变（如Y被W或F替代）的小鼠模型，以探究单个氨基酸变化对功能的影响。其次，他们利用流式细胞术、RNA测序（RNA-seq）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等手段，系统分析了突变小鼠体内T细胞、自然杀伤细胞、淋巴组织诱导细胞等多种免疫细胞的发育和功能异常。此外，研究还通过免疫共沉淀结合质谱分析、邻近连接实验（PLA）、体外AlphaScreen结合力测定以及分子动力学模拟等技术，从蛋白质互作、磷酸化修饰和结构层面揭示了Runx与TLE及酪氨酸激酶（如Lck、ZAP70）相互作用的动态调控机制。

结果

WRPW错义突变将Runx蛋白转化为组成型抑制因子

为了研究WRPY基序末端酪氨酸（Y）被色氨酸（W）取代（即WRPW突变）对内源性Runx蛋白功能的影响，研究人员构建了Runx3^WRPW（Rx3^W）小鼠。纯合Rx3^W/W小鼠表现出严重的肢体共济失调，并在约4周龄时死亡。胸腺中CD8⁺单阳性（SP）细胞的发育几乎完全被阻断，脾脏中成熟CD8⁺T细胞的数量也显著减少。此外，自然杀伤细胞、树突状表皮T细胞和朗格汉斯细胞的发育也受到严重抑制。RNA-seq分析发现，在Rx3^+/W小鼠的CD8⁺SP胸腺细胞中，细胞周期相关基因下调，且Tnk2和Il7r等基因的表达降低。ChIP-seq结果显示，虽然Runx3结合峰相似，但在Rx3^+/W细胞中，抑制性组蛋白标记H3K27me3从Runx3结合区域异常扩散，表明Runx3^WRPW蛋白可能作为强效抑制因子，拮抗了正常Runx3介导的基因激活。类似地，将Runx1的末端Y突变为W也导致了胚胎致死和造血干细胞的缺失，模拟了Runx1敲除的表型。这些结果表明，单个氨基酸的替换显著改变了Runx蛋白的功能，使其转变为一种组成型且具有显性负效应的转录抑制因子。

Runx^WRPW损害MHC-II特异性T细胞发育

为了评估内源性表达Runx1^WRPW对CD4⁺CD8⁺双阳性前体细胞谱系选择的影响，研究人员构建了在Rosa26位点诱导表达Flag标记的Runx1^WRPW或Runx3^WRPW的转基因小鼠（R26^DP-R1-WRPW和R26^DP-R3-WRPW）。研究发现，当这些突变蛋白在双阳性胸腺细胞阶段被诱导表达时，会显著减少MHC-II限制性细胞（本应分化为CD4⁺SP细胞）的数量，并将它们大量重定向至CD4^?CD8⁺谱系。即使在缺乏MHC-I的β2m^?/?背景或表达MHC-II特异性OT-II转基因TCR的小鼠中，Runx1^WRPW的表达依然能导致这种谱系重定向。进一步遗传学实验表明，这种效应依赖于TLE共抑制因子以及Zbtb7b (Thpok)基因座内的沉默子。当突变体在CD4⁺SP胸腺细胞（通过Thpok-Cre）中表达时，也能部分抑制CD4的表达，表明Runx1^WRPW在胸腺细胞分化的后期阶段仍具有显性功能。

Runx末端Y残基的突变影响其功能

研究人员进一步探究了将末端Y突变为其他氨基酸（如苯丙氨酸F或谷氨酸E）的影响。构建了表达Runx1^WRPF或Runx1^WRPE的转基因小鼠，以及内源性Runx3^WRPE（Rx3^E/E）和Runx3^WRPF（Rx3^F/F）的敲入小鼠。结果表明，Y被E取代（Runx1^WRPE）几乎破坏了与TLE3的结合，导致CD8⁺T细胞中Cd4基因的去抑制（即CD4表达上调）。而Y被F取代（Runx1^WRPF和Runx3^WRPF）则产生了与W突变类似但略弱的表现型：部分抑制了CD4⁺SP细胞的发育，并影响外周淋巴器官的形成。这表明，末端Y残基对于Runx蛋白的正常功能至关重要，F或W的替换可能模拟了磷酸化Y的状态，增强了与TLE的结合。

Runx1的磷酸化调控其与TLE3的结合

研究的关键在于探究Runx蛋白末端Y是否发生翻译后修饰。质谱分析在Jurkat T细胞中检测到了小鼠Runx1蛋白LEEAVWRPY肽段的磷酸化形式（LEEAVWRPpY）。在缺乏Lck激酶活性的J.CaM1.6细胞中，该磷酸化肽段的丰度大大降低，提示Lck可能参与其中。更重要的是，在从OT-I（MHC-I限制性）和OT-II（MHC-II限制性）小鼠中分选出的原代CD8⁺SP和CD4⁺SP胸腺细胞中，Runx1末端Y的磷酸化水平在CD8⁺SP细胞中比在CD4⁺SP细胞中高出约30倍。免疫共沉淀和质谱分析显示，磷酸化增强了Runx1与TLE3的相互作用。相反，用碱性磷酸酶处理会破坏野生型Runx1与TLE3的结合，但不影响Runx1^WRPF突变体与TLE3的结合，表明F突变可能绕过了磷酸化依赖的互作调控。染色质免疫共沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）证实，TLE3在野生型小鼠的CD8⁺SP胸腺细胞中特异性结合于Cd4沉默子区域，而在CD4⁺SP细胞中则无此结合。分子动力学模拟进一步支持，磷酸化的WRPpY和WRPF肽段与TLE3的WD40结构域的结合比未磷酸化的WRPY更稳定。

Runx1在CD8 SP胸腺细胞中与Lck和Zap70有更多相互作用

为了探究Runx与激酶的相互作用，研究人员利用AlphaScreen筛选和质谱分析，发现非受体酪氨酸激酶Lck、Fyn和ZAP70与Runx1存在相互作用，其中Runx1-ZAP70的相互作用在过钒酸盐处理后增强。通过邻近连接实验（PLA）在原代细胞中进行可视化观察，发现Runx1与Lck的相互作用在CD8⁺SP胸腺细胞中比在CD4⁺SP或双阳性胸腺细胞中更为显著，且这些相互作用信号主要位于细胞质区域。同样，Runx1-Zap70和Runx3-Lck的相互作用也在细胞质中被检测到。值得注意的是，在Zbtb7b^GFP/GFP小鼠中（其MHC-II限制性细胞被GFP标记并重定向至CD8⁺谱系），Runx1-Lck的相互作用在MHC-I信号的GFP^?CD8⁺SP细胞中比在MHC-II信号的GFP⁺CD8⁺SP细胞中更为丰富，提示这种相互作用的增加与MHC-I参与的TCR信号相关，而不仅仅是CD8⁺SP细胞分化的结果。

结论与讨论

本研究通过精巧的遗传学、生物化学和细胞生物学实验，揭示了T细胞谱系命运决定中一个关键的表观遗传调控开关。研究发现，Runx转录因子家族蛋白C末端保守的WRPY基序，其末端酪氨酸残基的磷酸化状态是调控其功能的关键分子开关。

在MHC-I信号的胸腺细胞中，更强的TCR信号（可能通过Lck等酪氨酸激酶）导致Runx1蛋白末端Y的磷酸化水平升高。这种磷酸化增强了Runx蛋白与转录共抑制因子TLE的亲和力，促进了TLE被招募到Cd4和Thpok基因座的沉默子区域，从而特异性关闭了辅助性T细胞谱系的基因程序，驱动细胞向细胞毒性CD8⁺T细胞分化。反之，在MHC-II信号的细胞中，Runx的磷酸化水平较低，其与TLE的结合较弱，使得沉默子不被激活，Thpok得以表达，进而促进CD4⁺辅助性T细胞的分化。

研究还发现，将末端Y突变为F或W，可以模拟磷酸化状态，使Runx蛋白与TLE组成型地强结合，从而将Runx转变为一种“超抑制因子”。这导致了发育异常，甚至在MHC-II限制性的细胞中也异常激活了沉默子，将其重定向至CD8谱系。

这项工作的意义在于，它首次在分子水平上阐明了TCR信号如何通过转录因子的特异性翻译后修饰（磷酸化），来精确调控下游的基因沉默程序，从而连接了“MHC限制性”与“谱系命运决定”这两个免疫学核心概念。它解答了长期以来关于Runx蛋白如何在相同细胞中兼具激活和抑制功能的疑问，并为理解其他发育过程中转录因子的双功能调控提供了新范式。该发现不仅深化了基础免疫学认知，也可能为未来通过干预此通路来调控T细胞分化（例如在肿瘤免疫治疗或自身免疫病中）提供新的潜在靶点。