《International Immunopharmacology》：A multi-omics R-loop–linked risk program highlights CKS2-positive proliferative tumor cells as drivers of glioma growth
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胶质瘤R-loop转录程序风险签名研究：通过多组学分析发现R-loop活性升高与预后不良及免疫治疗抵抗相关，构建的风险评分模型优于现有145个签名，并鉴定MYBL2-CKS2轴及GSK269962A作为潜在治疗靶点。
唐伟春|胡尚尚|童旭|李强|王晓勇|李玉波|顾彪|王楠楠
中国安徽省蚌埠市蚌埠医学院附属第三人民医院，邮编233000
摘要
目的：开发一种基于R-loop相关转录程序的通用性胶质瘤风险特征，评估其预后预测和免疫治疗预测能力，并确定其细胞和调控决定因素。
方法：我们通过大规模多组学胶质瘤队列的共识聚类，量化了R-loop活性（ssGSEA）并定义了亚型。在TCGA中训练了一个预后模型，并在CGGA/GEO中进行了验证，通过整合多组学分析和靶向实验评估了免疫治疗的相关性、细胞定位以及关键驱动因素/治疗方法。
结果：与正常组织相比，胶质瘤中的R-loop活性升高，且随着WHO分级的增加而增加，一致性地预示着较差的生存预后。共识聚类识别出一个R-loop高表达的亚型，该亚型具有最差的预后和免疫逃逸特征。所得风险评分在多个队列中稳健地分层了生存情况，表明免疫治疗获益的概率较低，并且优于已发表的145个胶质瘤特征。单细胞和空间分析将高风险程序主要映射到增殖（周期）肿瘤细胞状态。在特征基因中，CKS2是主要贡献者：它在mRNA和蛋白质水平上均上调，与不良结果相关，并在功能上促进胶质瘤增殖和克隆形成，同时抑制凋亡；CKS2的沉默抑制了异种移植的生长并减少了Ki-67染色。Regulon推断和ChIP–qPCR支持MYBL2作为CKS2的上游转录调控因子。药物敏感性分析优先考虑了GSK269962A，该药物在CKS2高表达细胞中表现出更强的体外活性，分子动力学模拟支持GSK269962A与CKS2的稳定结合。
结论：基于R-loop的风险特征能够实现胶质瘤的稳健预后和免疫治疗分层，并将MYBL2–CKS2轴及其相关脆弱性确定为潜在的转化靶点。
引言
胶质瘤是中枢神经系统中最常见和最致命的原发性肿瘤之一，其特征是显著的分子和细胞异质性[1]，[2]。尽管已建立的生物标志物（如突变状态、1p/19q缺失和MGMT启动子甲基化）已被纳入临床分层，但患者间的预后和治疗反应的差异仍然未能得到充分解释。这一限制在免疫治疗等新兴策略中尤为明显，因为响应者的比例较低，且缺乏稳健、通用的预测指标[3]，[4]，[5]。因此，迫切需要开发能够捕捉关键病理过程的风险特征，并在独立队列中进行验证，以推进胶质瘤的精准管理。
R-loop是由DNA–RNA杂合物和一条位移的单链DNA组成的核酸结构，通常在转录和复制过程中形成[6]，[7]。R-loop稳态的破坏可引发转录-复制冲突、复制压力和DNA损伤，从而促进基因组不稳定并驱动恶性进展[8]，[9]。越来越多的证据将R-loop相关通路与肿瘤增殖、DNA修复的重编程以及免疫微环境的变化联系起来。然而，在胶质瘤中，对R-loop相关转录程序的系统表征仍然有限。具体而言，基于R-loop生物学的稳健预后模型很少，对相应细胞状态、上游调控轴和可靶向治疗线索的整合分析仍然缺乏[10]，[11]，[12]。
为了解决这些不足，我们量化了多个大规模胶质瘤队列中的R-loop活性，并识别出与不良结果相关的R-loop高表达表型。接下来，我们构建并外部验证了一个与R-loop相关的预后模型，并评估了其与免疫治疗反应的相关性以及肿瘤微环境特征。最后，利用单细胞和空间转录组学技术绘制了风险程序的细胞来源，并优先确定了候选调控因子和治疗脆弱性。
部分摘录
多组学队列纳入
我们整合了多个公开可用的多组学胶质瘤队列进行系统分析。对于大规模转录组分析，TCGA-LGG/GBM作为训练和主要发现队列，外部验证在CGGA-325、CGGA-693 [13]和GSE108474 [14]中进行。对于肿瘤-正常组织比较，TCGA肿瘤样本与GTEx中的正常脑组织一起分析，此外还包含了GSE4290作为独立的正常对照进行验证。对于单细胞分析
基于R-loop相关基因集的R-loop评分构建及其临床和免疫治疗相关性
在五个大规模胶质瘤队列和一个抗PD-1数据集中，我们通过ssGSEA量化了R-loop评分，并根据中位活性对肿瘤进行了分层（图1A）。R-loop活性在肿瘤中始终高于正常脑组织，在胶质母细胞瘤中富集，并随着WHO分级的增加而逐步升高，在IV级疾病中达到峰值（图1B–D）。临床上，高R-loop评分的患者在多个独立队列中的总体生存期显著较短（图1E）。从分子水平上看，R-loop高表达的肿瘤
讨论
本研究建立并验证了一个基于R-loop转录程序的胶质瘤风险分层框架。在多个队列中，R-loop评分在肿瘤中始终升高，且在高级别样本中更为明显，并与较差的生存预后相关。共识亚型进一步识别出一个R-loop高表达的亚型，该亚型的预后最差，其特征是与细胞周期、DNA复制和DNA修复相关的增殖相关程序富集。
结论
总之，我们开发并验证了一个基于R-loop的风险特征，该特征能够稳健地分层胶质瘤的预后，并指示免疫治疗获益的差异可能性。多组学分析将风险程序定位到免疫逃逸微环境中的增殖肿瘤细胞状态。从机制上讲，我们确定MYBL2–CKS2轴是关键驱动因素，CKS2促进胶质瘤生长，并将GSK269962A确定为CKS2高表达肿瘤中的潜在脆弱性。
作者贡献
WT和SH分析了本研究的所有数据并完成了手稿。XT、XW、YL、BG、NW和QL进行了体外实验。SH设计了研究思路并审查和修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最终手稿。
CRediT作者贡献声明
唐伟春：验证、软件、资源、方法学、正式分析、数据管理。胡尚尚：写作 – 审稿与编辑、写作 – 初稿、项目管理、方法学、调查、数据管理、概念化。童旭：可视化、软件、方法学。李强：可视化、软件、资源。王晓勇：软件、方法学。李玉波：资金获取、正式分析。顾彪：可视化、方法学、调查。王楠楠：软件
伦理批准
所有动物实验均获得了南京第一医院机构动物护理和使用委员会的批准，并按照ARRIVE指南和美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行。人类转录组和临床数据的分析基于公开可用的去识别数据集（TCGA/CGGA/GEO）；因此，生物信息学部分不需要额外的伦理批准或知情同意
资助
本研究得到了安徽省教育厅重点自然科学研究项目（2025AHGXZK31548）、蚌埠市中心医院自然科学重点项目（2025bbsy04）、安徽省肿瘤进化与智能诊断和治疗重点实验室开放项目（KFKT202410）、蚌埠市卫生健康委员会科学研究项目（BBWK2024A209）以及蚌埠医学院科学研究项目（2023byzd121）的支持
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的报告。
