极性-和序列依赖性治疗性抗体-siRNA缀合物的电离：实现完整多属性方法用于全面表征和身份放行检测

《Analytical Chemistry》：Polarity- and Sequence-Dependent Ionization of Therapeutic Antibody–siRNA Conjugates: Enabling Intact Multi-attribute Method for Comprehensive Characterization and Identity Release Assay

　　

抗体-siRNA缀合物(ARC)代表了一种将小干扰核糖核酸(siRNA)递送至靶向细胞、组织或器官的有前景方法。这些分子的复杂性在工艺开发和制造放行过程中对识别、表征和监测其关键质量属性(CQA)提出了巨大分析挑战。研究人员开发了一种新方法，即完整多属性方法(iMAM)，用于ARC表征，该法采用天然尺寸排阻色谱质谱(SEC-MS)。iMAM提供了一种简单有效的方法来监测CQA，如身份、纯度、高分子量物质(HMWS)、低分子量物质(LMWS)、N-糖基化、未结合半胱氨酸的修饰、接头水解以及药物-抗体比(DAR)。该方法在良好生产规范(GMP)环境中被评估并确认为ARC原料药(DS)和药品(DP)身份放行检测。在方法开发过程中，研究人员发现ARC的电离谱取决于质谱操作极性。在正极性下，更多双链siRNA保留在ARC分子上，而在负极性下则存在更多带有单链RNA的ARC分子。同时，与单独siRNA相比，ARC中抗体的存在在电离过程中为siRNA双链提供了某种程度的保护。质谱检测中ARC分子上siRNA双链的比例与其GC含量或熔解温度(T_m)相关。这些发现为ARC电离过程中siRNA与抗体之间的关系提供了基本理解，并促进了ARC表征有效方法的开发。

抗体-siRNA缀合物(ARC)结合了大分子、小分子和寡核苷酸，其物理和生化差异给分析表征带来挑战。siRNA高度带负电，通常需要离子对试剂才能有效保留，而抗体则在正离子模式下电离最优。传统上，ARC的多重质量属性需用不同技术（如阴离子交换色谱测DAR、尺寸排阻色谱测聚集）分别评估，但单一方法难以全面覆盖，尤其是DAR1二聚体与DAR2的区分。本研究旨在开发一种基于天然SEC-MS的完整多属性方法(iMAM)，实现ARC关键质量属性(CQA)的同步监测，并验证其作为GMP身份放行检测的可行性。样本来自Eli Lilly and Company，包括五种ARC分子（ARC-1至ARC-5）、SS缀合物及siRNA-linker-1。主要关键技术为天然尺寸排阻色谱质谱(SEC-MS)，采用HESI源和正负离子模式，流动相为50 mM醋酸铵，通过优化盐浓度和离子源参数（如气化器温度、气体流速）实现高效分离与电离。该方法整合了UV检测（260 nm）和质谱全扫描，并利用Extended MS谱同时收集siRNA和ARC相关离子。

**天然SEC-MS方法开发**：研究人员通过制备不同DAR物种（DAR0、DAR1、DAR2）的ARC-4，以50 mM醋酸铵在SEC柱上分离，重叠UV色谱图显示各DAR物种可有效分离，且质谱电离良好，验证了该方法对DAR表征的适用性。

**ARC电离的观察**：研究人员发现，在正极性下，ARC分子主要保留完整siRNA双链；在负极性下，则主要丢失反义链(AS)，仅剩抗体-正义链(SS)缀合物。ARC-4中siRNA双链在负极性下完全解离，但单独siRNA双链（无抗体）在相同条件下更易解离，表明抗体对siRNA双链具有稳定作用。此外，不同ARC的siRNA序列导致电离行为差异：GC含量或熔解温度(T_m)越高，正负极性下检测到的完整ARC比例越高，两者呈线性相关（正极性R2=0.8763，负极性R2=0.9394）。这是首次观察到siRNA序列对ARC电离的影响，提示需根据序列优化MS方法。

**天然SEC-MS方法作为身份方法**：身份检测需满足ICH指南要求。研究人员利用四种ARC在正负极性下不同的电离特征（如ARC-1在正极性下无完整优势，ARC-4在负极性下无AS丢失优势）作为第一因子，同时通过Extended MS谱准确测量各组分（完整ARC、丢失AS的ARC、游离AS）的分子量（偏差<100 ppm）及AS的100%序列覆盖率作为第二因子，构建了双因子身份方法，显著提高了特异性。

**天然SEC-MS方法作为iMAM方法**：与常规分析型SEC（磷酸盐/氯化钠流动相）相比，MS兼容型SEC（醋酸铵）在HMWS、单体、LMWS的分离和纯度检测上表现相当（图6）。通过去卷积质谱，可同时鉴定未结合半胱氨酸的胱氨酸化修饰、N-糖基化模式及热应激样品中+18 Da的接头水解产物。为区分真实游离siRNA杂质与MS假象，研究人员优化了温和正离子模式（降低气化器温度至150°C、气体流速），使最低GC含量（26%）的ARC-1无AS丢失；同时通过加标实验和SEC分离，证明游离AS在色谱中保留时间不同（约16 min），且Extended MS谱可对其完全测序，从而可靠鉴定游离杂质。此外，该方法还能鉴定siRNA-linker中间体（基于单同位素分子量），并监测其通过retro-Michael加成释放的情况，增强安全性。

**iMAM方法在GMP环境中的验证**：在两个GMP实验室中评估了特异性、重复性和溶液稳定性。三份DS平行制备的色谱图一致，且与基质可区分；测量分子量的RSD<1%，在5°C下稳定3天。该方法成功验证，适用于ARC DS和DP的放行检测。

**总结与讨论**：本研究开发的iMAM方法在单次分析中可同时监测6种以上CQA，包括身份、DAR、HMWS/LMWS、N-糖基化、未结合半胱氨酸/接头修饰及siRNA解离。该方法的平台性可扩展至抗体中间体和siRNA-linker中间体的鉴定，减少了对有机溶剂的使用，促进了环境可持续性。研究结论：研究人员开发了iMAM方法来确认ARC身份并在工艺开发和产品放行中进行表征。首次观察到ARC在正负极性下电离不同：ARC上的siRNA双链在正极性下倾向于保持完整（即使源温度高于其熔解温度），但在负极性下更易解离。此外，负极性下siRNA双链的解离与其GC含量或熔解温度高度相关，表明与siRNA序列相关的特征电离行为。结合负极性下ARC的特征电离行为与各组分的精确质量测量（完整ARC、ARC-AS和/或AS的完整质量和/或特征测序离子），身份方法实现了对ARC的高度特异性。除确认ARC身份外，iMAM方法还可作为平台方法确认siRNA-linker中间体和抗体中间体的身份。iMAM方法可在单次分析中同时监测多个CQA，包括未结合半胱氨酸或接头修饰、N-糖基化、ARC大小变异体（HMWS、LMWS、单体纯度）、siRNA解离和DAR分布。最后，iMAM方法已在两个GMP实验室中验证为身份放行检测，证明了其在处理复杂新模态的GMP测试站点全球实施的可行性。