非正常精子患者的精子质膜电位作为辅助生殖技术中受精成败的标志

《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》：Sperm plasma membrane potential as a marker for fertilization success for non-normozoospermic patients undergoing assisted reproduction technologies

　　摘要

目的：精子分析是评估男性生育能力的标准工具，但它经常无法准确预测受精结果。我们研究了精子质膜电位（Em）是否可以用来预测非正常精子的受精成功率。

方法：本研究包括119名精子异常男性的 semen 样本，这些男性正在进行体外受精（IVF）或胞浆内精子注射（ICSI）。临床辅助生殖技术（ART）程序完成后，剩余的精子用对 Em 敏感的染料 DiSC3(5) 和碘化丙啶染色以评估其活力。通过时间延迟流式细胞术评估精子 Em，并将其与受精结果相关联。

结果：对 Em 值的无监督聚类显示了三个具有不同膜极化程度的患者组。值得注意的是，Em 值更低（去极化程度更高）的样本与较低的受精率（<60%）相关，而 Em 值更高（超极化程度更高）的样本与较高的受精率（60%）相关。这种相关性仅在 IVF 患者中观察到，而在 ICSI 患者中没有观察到。

结论：尽管存在个体间差异，精子 Em 可以作为辅助工具来预测具有精子异常的患者在 IVF 期间的受精潜力，从而为 ART 的临床决策提供有价值的信息。

引言：不孕症定义为夫妇在正常无保护性行为后一年内无法怀孕的情况，目前全球约有17.5%的成年人受到不孕症的影响[1, 2]。大约50%的不孕症病例归因于男性因素，生活方式和基因改变在其中起着重要作用。然而，大约30%的不孕症病例原因不明，被认为是特发性精子障碍[1]。传统的 semen 分析方法主要评估 semen 体积、精子浓度、前向运动能力和形态，通常不足以诊断男性不孕的原因[2,3,4]。因此，开发功能测试以预测精子的受精能力是非常重要的，这些测试可以在日常生活中轻松应用于临床实践。在生理条件下，受精精子的选择发生在女性生殖道中，通过一个涉及多种生化变化的 capacitation 过程[5,6,7]。理解这些变化对于辅助生殖技术（ART）的发展至关重要。在 capacitation 过程中，质膜的胆固醇被去除，脂质重新排列，增加了其离子通透性[8]。此外，细胞内 pH（pHi）和 Ca2+ 浓度（[Ca2+]i）增加，质膜电位（Em）超极化[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。Em 的超极化是与 capacitation 相关的关键分子事件，对于获得受精能力至关重要。据估计，未 capacitated 的小鼠精子的 Em 相对较低（约 -35 mV），而 capacitation 后的 Em 增高（约 -70 mV[14,15,16,17,18,19]。在人类中，只有部分精子在体外 capacitation 期间发生 Em 超极化[12]，其值在 -40 和 -80 mV 之间[20, 21]，分别对应未 capacitated 和 capacitated 的精子。这种 Em 超极化对于人类精子的 capacitation 完成是必要的[12]。利用电生理技术和对 Em 敏感的荧光探针的研究表明，去极化的精子膜电位与 IVF 循环中的受精成功率降低相关，但在 ICSI 中则没有这种关系[20, 22, 23]。然而，这些发现主要基于对正常精子的分析，尽管非正常精子患者在接受 ART 的人数中占很大比例。其中，畸形精子症（teratozoospermia）尤其普遍，这是一种由精子形态异常引起的状况，通常与精子功能受损有关，但在这一背景下尚未得到充分研究。鉴于在 ART 过程中非正常精子患者（包括畸形精子症患者）的比例较高，开发可靠的生理标志物对于改善对其精子受精能力的评估至关重要。为了解决这个问题，我们使用时间延迟流式细胞术（TLFC[21]）在单细胞水平上评估存活精子的 Em。这种方法可以识别具有异质生理状态的 semen 样本组。利用 TLFC，我们研究了在 IVF 或 ICSI 过程中的非正常精子患者的精子样本中 Em 的评估是否可以作为受精成功的功能预测器。

材料与方法：本研究使用了2022年3月至2023年7月期间在 fertility clinic 接受生育治疗的患者的 semen 样本（年龄为38.7 ± 4.7岁）。Em 评估仅在每个患者确定并完成 ART 程序后剩余的 semen 样本上进行。此外，排除了冷冻 semen 样本和授精卵子数量少于4个的程序。应用这些标准后，我们共有119个 semen 样本，占诊所治疗患者的24%（图1A）。

图1：样本纳入标准和使用时间延迟流式细胞术测定人类精子 Em 的方案。A：整个研究期间 fertility clinic 进行的 ART 循环总数，仅考虑使用四个或更多卵子和新鲜 semen 样本的循环。共有119个样本的精子量足够进行 Em 分析。B：流式细胞术层级门控策略和点图，根据大小和复杂性选择精子（侧散射“SSC-A”与前向散射“FSC-A”）。伪彩色尺度表示事件密度。然后，使用散射信号图（前向散射（“FSC-area”与“FSC-height”）区分细胞聚集体和单个细胞。接着，选择活精子（PI?，活的）并排除死精子（PI+，死的）。对活细胞进行 DiSC3(5) 荧光的时间延迟采集。为了 Em 校准，添加了 valinomycin 和 KCl（用箭头表示）。C：使用 Nernst 方程和校准中每个轨迹的平均荧光值（使用 valinomycin（1 μM）和不同浓度的 KCl（5, 10, 20, 和 35 mM KCl）进行线性插值，计算每个样本的基线 Em 值。Nernst 方程的定义如下：VEq 是离子的平衡电位（mV）；R 是通用气体常数（8.314 J/mol·K）；T 是绝对温度（开尔文）；z 是离子价数；F 是法拉第常数（96,485 C/mol）；ln 是自然对数（基数 e）；[X]out/[X]in 是细胞外/内的离子浓度。D：在基线和不同 KCl 刺激下的计算 Em 值的代表性荧光密度直方图。

为了获得 Em 参考值，我们还分析了14名正常精子捐赠者的 semen 样本（年龄为29.3 ± 6.1岁），这些捐赠者通常用于辅助生殖循环，并使用 bank semen，尽管在本研究中捐赠者的样本未用于 ART 循环。根据 WHO 实验室手册中的协议进行 semen 分析，以将样本分类为正常精子（精子浓度（×10^6/mL）≥16；前向运动能力（%）≥32；正常形态（%）≥4）或非正常精子。所有纳入本研究的非正常精子样本都被分类为畸形精子（正常形态<4%）。大多数患者仅被诊断为畸形精子症（n=96，80.7%），其他人还被诊断为低畸形精子症（n=15，12.6%）和弱畸形精子症（n=8，6.7%）（补充表 I）。

介质和试剂：使用商业 HTF HEPES 介质（Human Tubal Fluid medium；InVitroCare Inc，CA，USA）和10%人类血清白蛋白（HSA；InVitrocare Inc，CA，USA）制备 capacitated 培养基（Cap media）。荧光染料 3,3′ dipropylthiadicarbocyanine iodide（DiSC3(5)）来自 ThermoFisher Scientific（Waltham，MA，USA），碘化丙啶（PI）来自 Molecular Probes InVitrogen, Inc.（Eugene，OR，USA）。荧光染料和测试化合物储备溶液制备在二甲基亚砜（DMSO）中，除了 KCl，它是在蒸馏水中制备的。

精子样本采集和准备：精子样本（捐赠者和患者）在取卵当天获得。样本通过在性禁欲2-5天后的自慰获得，并在室温下液化10-15分钟。根据 WHO 的建议[24]，使用 SpermCare 上层（90%）和下层（45%）（InVitroCare Inc，CA，USA）通过密度梯度分离技术回收活动精子。简而言之，按体积比1:1的比例使用每个梯度和 semen 样本。将样本放置在梯度上后，在室温下以1200 × g 离心10分钟，然后用洗涤介质?洗涤一次沉淀物。样本再次在室温下以1200 × g 离心7分钟。最后，丢弃上清液，将沉淀物重新悬浮在70-160 μL中。在需要进行常规 IVF 或 ICSI 程序的样本中，将剩余样本调整到1 × 10^6细胞/mL的浓度，用于使用 TLFC 进行 Em 测定。最终精子浓度使用 Makler Counting Chamber（SEFI，Medical Instruments LTD，海法，以色列）确定。

时间延迟流式细胞术程序：荧光数据作为单个细胞事件记录在 BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）上。所有细胞事件的采集都在室温下连续模式下进行，流速为14 μL/min；每种条件下至少采集200,000个事件。选择单个活精子的门控策略按照 Matamoros-Volante 2020[21]之前描述的方法进行。简而言之，记录每个样本的前向散射（FSC）和侧散射（SSC）数据，并设置 FSC 和 SSC 的阈值，以排除细胞碎片和片段。然后，制作 FSC 高度（FSC-H）与 FSC 面积（FSC-A）的二维密度图，以消除细胞聚集体，只留下单个精子。最后，仅考虑活细胞进行分析（PI 阴性）（图1B）。为了测量 DiSC3(5) 荧光，使用640-nm 激光激发细胞，并在装有670 nm LP 滤光的 FL4 通道中检测其发射。使用488 nm 激光检测 PI 荧光，并使用533/30 nm 滤光器（FL1 通道）采集发射。

人类精子 Em 静息值的确定：在实验开始前4-5分钟，用100 nM的 DiSC3(5) 染色精子。一旦 DiSC3(5) 荧光达到稳态值，就开始 Em 校准，然后加入1 μM valinomycin 以诱导 Em 超极化；之后，每180秒添加三种不同浓度的 KCl。这些 KCl 添加导致最终的细胞外 K+ 浓度分别为5、10、20和35 mM，对应的理论 Em 值分别为 -82、-64、-46和-32 mV（图1B-C）。使用 Nernst 方程获得理论 Em 值，假设细胞内 K+ 浓度为120 mM[12, 25]。为了从 DiSC3(5) 荧光计算 Em 值，在达到平台值后获得中位荧光值；在每次添加 K+ 脉冲后，将值与其相应的理论 Em 绘制在一起。通过将理论 Em 值与校准曲线中每个轨迹的平均荧光值进行线性插值，计算每个精子样本的初始静息 Em 值（图1D）。每次录制的持续时间约为20分钟。

### 对辅助生殖技术（ART）受精率的评估
临床胚胎学家（与本研究无关联）执行了所有的ART程序，并为每位患者确定了适当的治疗方案，包括是否使用ICSI或IVF的决定。用于评估精子膜电位（Em）的样本仅在ART程序开始后收集，以确保研究不会干扰临床工作流程或患者的治疗。受精率由临床胚胎学家根据标准指南[26]计算得出，这些数据被提供给本研究使用。本研究的结果或观察结果并未影响胚胎学家或医疗从业者的决策。

### 数据分析与统计
来自BD Accuri C6 Plus软件的流式细胞术实验数据以Flow Cytometry Standard (FCS)格式导出，并首先使用FlowJo软件版本10.1进行初步分析（FlowJo, LLC，美国阿什兰）。接着，用DiSC3(5)染色的活性单细胞的荧光和时间数据被导出为逗号分隔值（CSV）格式，然后使用RStudio版本1.3.1093中的自定义脚本进行分析（RStudio Team，2020年）。我们采用了两种方法来研究基础膜电位（Em）的作用：一种是传统的统计方法，用于比较对照组和非正常精子患者的平均值；另一种是无监督机器学习方法，在这种方法中，假设患者群体内部存在异质性，通过聚类层次分析来识别亚群。簇的数量是根据树状图分支结构定义的截止高度来选择的。在聚类之前，Em数据经过了z标准化处理。通过残差的图形检查来评估数据的正态性。当数据呈正态分布时，使用Student’s t检验比较对照组和患者组；当数据不呈正态分布时，使用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA）并进行Tukey事后检验。最后，进行了Pearson相关性分析，以评估基础Em与ART中的受精率（包括IVF和ICSI）之间的关系。Em值以平均值±标准误差（mean ± SE）的形式表示，并在箱形图中以中位数表示。p值<0.05被认为具有统计学意义。箱形图表示四分位距（IQR），从第一四分位数（Q1）到第三四分位数（Q3），中位数由箱内的水平线表示。 whiskers延伸到1.5 × IQR范围内的最极端值（IQR = Q3–Q1），Q1以下和Q3以上的数据点被视为异常值。所有分析都是使用Python（版本3.9）在Jupyter Notebook（版本6.4.5）上运行完成的，该Jupyter Notebook运行在Anaconda平台（版本2022.6）上。图表的最终版本是用Inkscape 0.91制作的（Inkscape.org）。包含所有用于分析的完整数据集的补充表1见附录。

### 结果
### 有生育问题的患者表现出不同的精子基础膜电位
精子膜电位的超极化已被提出是精子 capacitation 的标志，并与接受IVF的正常精子患者的受精结果相关[25, 27, 28]。在本研究中，我们评估了正常精子捐赠者（n = 14）和非正常精子患者（n = 119）的基础Em，其中只有后者进行了ART周期。比较正常精子捐赠者与非正常精子患者时，未观察到平均基础Em的显著差异（图2A，p = 0.59）。为了探讨与ART程序类型相关的潜在差异，我们根据治疗方案将非正常精子患者进一步细分：常规IVF（n = 86）或ICSI（n = 33）。这两个ART组之间的平均基础Em值没有差异（图2B，p = 0.61）。此外，无论是IVF组还是ICSI组与正常精子捐赠者组相比，也没有显著差异（图2B，捐赠者 vs IVF，p = 0.31；捐赠者 vs ICSI，p = 0.52）。

### 非正常精子患者表现出不同的基础膜电位
A. 比较了正常精子捐赠者（n = 14）和所有非正常精子患者（n = 119）样本的基础Em值（p = 0.59），分别用鲑鱼色和粉红色表示。组间比较使用了独立t检验（B），根据ART程序分为常规IVF（n = 86）或ICSI（n = 33），分别用粉红色和紫色表示。C. 显示了所有非正常精子患者的分类簇：Atypical（绿色，Em > ?12 mV）、Depo（蓝色，Em > ?49 mV）、Inter_hyp（粉色，Em ?50至?80 mV）和High_hyp（紫色，Em < ?81 mV）。簇间比较使用了Kruskal–Wallis检验，并对非参数数据进行了Dunn’s检验和Bonferroni校正；ns，无显著差异。D. 来自每个分类簇的捐赠者和患者的DiSC3(5)标准化荧光和Em校准曲线。在每次记录中，添加了valinomycin以诱导Em的超极化，随后进行了三次KCl的去极化脉冲。

尽管在上述组之间未检测到平均基础Em的显著差异，我们想知道精子膜电位的个体间变异性是否可能揭示出功能不同的亚群。先前关于人类和小鼠精子的研究已经表明，Em在细胞间并不均匀，并且个体间存在相当大的变异性[11, 12, 20]。为了探索这种潜在的功能异质性，我们使用所有非正常精子患者的Em值进行了无监督层次聚类分析。通过评估随着簇数增加而解释的总方差比例（“肘部”方法）来确定簇的数量（补充图1），结果表明四个簇最适合后续分析。这些簇根据其特征Em值进行了定义和命名：高度超级极化的簇（Cluster 1，High_hyp，n = 62）、中度超级极化的簇（Cluster 2，Inter_hyp，n = 34）、高度去极化的簇（Cluster 3，Atypical，n = 3）和去极化的簇（Cluster 4，Depo，n = 20）（图2C）。每个簇的平均患者年龄和相关精子参数，如精液体积（mL）、浓度（精子 × 10^6/mL）、形态（%正常）和前进运动能力（%），总结在补充表2中。

最后，我们将每个患者簇的平均Em值与捐赠者的值进行了比较，后者作为参考范围（?50至?80 mV；图2C）。捐赠者与Atypical（p = 0.02）、Depo（p < 0.001）和High_hyp（p < 0.001）簇之间存在显著差异。High_hyp簇也与Atypical（p = 0.03）、Depo（p < 0.001）和Inter_myp（p < 0.001）簇存在显著差异（图2C）。Inter_myp簇也与Atypical（p = 0.04）和Depo（p < 0.001）簇存在显著差异。捐赠者与Inter_myp簇之间没有显著差异（p = 1，ns）（图2C）。簇间的差异可以在图2D中显示的Em校准实验的代表曲线中看到。

### 基于Em的簇显示非正常精子患者中超极化与较高的IVF受精成功率相关
接下来，我们评估了整个患者队列（n = 119）中基础Em簇与受精率之间的关联（图3A）。Depo簇显示出比Inter_myp和High_hyp簇显著更低的平均受精率（两者p < 0.001）。Inter_myp和High_hyp簇之间没有显著差异（p = 0.85）。Atypical簇的受精率与Depo（p = 0.85）、Inter_myp（p = 0.18）或High_hyp（p = 0.12）簇之间没有显著差异。

### 基于ART类型的分析
当基于ART类型进行分析时，主要在IVF组（n = 86；图3B）中观察到显著差异。在这个组中，Depo簇的受精率显著低于Inter_myp（p = 0.011）和High_hyp（p = 0.001）簇。与整个队列类似，Inter_myp和High_hyp之间没有显著差异（p = 0.63），或者Atypical簇与任何其他簇之间也没有显著差异（所有p > 0.05）。相反，在ICSI组（n = 33；图3C）中，四个基于Em的簇之间的受精率没有显著差异（所有p > 0.05）。需要注意的是，由于某些簇中的数据点数量较少，统计分析的效力不足；因此，图3中的结论应谨慎对待。

### 基于临床相关性的评估
为了评估基础Em的临床相关性，我们根据传统的60%受精率阈值[26]比较了Em值。在接受IVF的患者中，受精率≥60%的患者表现出显著更极化的（更负的）基础精子Em值（中位数约为?75 mV），而受精率<60%的患者则相反（中位数约为?65 mV；p < 0.001；图4A）。接受ICSI治疗的患者也显示了类似的趋势，即更高的受精率与更极化的Em值相关；然而，这种差异在统计上并不显著（p = 0.15；图4A），这可能是由于该组样本量较小。

### 进一步分析
使用条形图（图4B）进一步分析了四个Em簇的受精阈值，结果表明，在IVF和ICSI中，Inter_myp和High_hyp簇中的大多数患者实现了≥60%的受精率（由绿色条形表示），而Depo簇则没有。这一观察强烈表明，更极化的基础精子Em与实现临床上有利的受精结果相关。最后，我们分析了所有患者中基于Em的基底精子电位与受精率（%）之间的相关性，分析按ART类型进行了分层（图4C）。在IVF患者中，观察到基础精子电位与受精率之间存在显著的负相关（r = ?0.334；p = 0.0016），再次表明Em的超极化与受精率的增加显著相关。对于ICSI患者也进行了类似的分析，结果显示基础精子电位与受精率之间存在负相关趋势；然而，没有观察到显著差异（r = ?0.229；p = 0.199）。

### 总结
我们的结果表明，基础精子膜电位（Em）与非正常精子患者在接受常规IVF时的受精成功率相关，而在ICSI中的相关性较低。具体来说，表现出更极化（即更负的）Em值的精子样本与显著更高的受精率相关，而去极化的样本（即更正的）则与较低的受精成功率相关。这种关系通过无监督聚类和相关性分析得到证实，突显出Em作为预测非正常精子患者受精能力的潜在功能性生物标志物。这些发现与先前在正常精子样本中的研究结果一致，即更负的Em与更高的超激活率、顶体反应率和最终的受精率相关[20, 23]。精子Em与ART中受精率之间的关系是一个正在发展的研究领域。先前关于正常精子样本的研究表明，更极化的Em与更高的受精率相关[20, 23]。相反，去极化的Em在不育男性中常见，并且与较低的IVF成功率相关[20, 22, 23]。大多数先前探讨精子Em与受精结果之间关系的研究都是在正常精子捐赠者中进行的，这限制了其转译相关性。相比之下，我们的研究专门关注非正常精子患者，这类患者在临床环境下接受辅助生殖技术（ART）的比例很高[29]。例如，在我们的生育诊所中，超过95%的精液样本被归类为非正常精子，其中畸形精子是最常见的诊断结果。根据世界卫生组织（WHO）的标准，畸形精子定义为形态正常精子比例低于4%，可能单独存在，也可能与其他异常同时出现，如精子活动力降低（弱畸形精子）或精液量减少（少畸形精子）[30,31,32]。通过对这一临床异质性群体中的精子Em进行评估，我们证明了即使在精子参数异常的患者中，Em超极化仍具有预测价值，尤其是在常规体外受精（IVF）的背景下。

人类精子以及其他多种物种的 capacitation（精子成熟过程）涉及质膜的显著变化，其中之一就是质膜超极化。这一过程会导致膜负电位增加，通常达到约-60至-70 mV的水平[12, 33]。超极化主要是由介导H?离子外流和K?离子内流的离子通道活动驱动的。过度去极化的精子可能会在这些通道的调节上出现缺陷，从而影响后续步骤的进行，如活动力的增强、顶体反应、精子与卵子的识别与融合——这些都是受精所必需的关键事件[10, 12, 34]。形态异常精子（畸形精子）的存在与capacitation过程缺陷或质膜完整性受损有关[32, 35, 36]。极度超极化或过早的超极化状态可能导致能量耗竭（鉴于畸形精子与线粒体功能障碍的关联[37, 38]），或者引发顶体反应过早发生，从而在到达卵子之前就损害了精子的功能能力[38]。然而，在我们的研究中，我们并未观察到高超极化精子患者的受精率呈现负相关。

使用流式细胞术等技术测量Em可以为预测畸形精子样本的功能提供有效方法，从而克服传统精液分析的局限性。在这项工作中，我们评估了接受生育治疗（无论是IVF还是ICSI）的非正常精子样本的Em值。值得注意的是，通过无监督的层次聚类分析Em值，我们识别出四个不同的患者亚群，反映了个体间的显著差异。这种差异可能源于多种因素，如精子成熟度、capacitation状态以及患者的生活方式等。此外，已知只有一部分人类精子在capacitation过程中会出现Em超极化[12]。有趣的是，我们观察到在接受常规IVF的患者中，Em值越高，受精率也越高。然而，这种关联在ICSI患者中则不那么明显。这种差异可能是由于ICSI程序本身导致的——该程序绕过了精子必须克服的生理屏障，同时我们的样本量较小。另一个实验异质性的来源可能是样本采集与Em测量之间时间间隔的变化。尽管这个时间间隔取决于临床工作流程（当有剩余样本可用时）。我们的做法是在所有情况下将测量时间标准化（大约90分钟）。

理解精子Em调控机制对于理解受精过程中的精子功能至关重要，这可能有助于推进男性不育症的诊断。我们的研究强调了精子Em在男性生育中的重要性，并且可以被视为辅助生殖技术中预测受精率的参数，甚至适用于非正常精子患者。值得注意的是，最新的WHO精液分析手册[24]现在建议使用补充的功能测试来评估男性生育能力。在这种情况下，我们的发现进一步证实了Em超极化（capacitation的标志）是预测受精成功的潜在指标，至少在常规IVF周期中是这样。

在小鼠精子中，Em的超极化是精子capacitation过程中的关键步骤，它是准备精子进行顶体反应的必要且充分条件[10]。De la Vega-Beltran等人的研究[10]表明，当精子质膜发生超极化时，可以启动适当的Ca2?信号传导，这对触发顶体反应至关重要。相反，如果阻止这种超极化，即使其他与capacitation相关的过程存在，精子也将无法作出适当反应[10]。对于人类来说，Em也被认为是受精能力的重要生物物理标志物，因为超极化是激活精子中关键信号通路的绝对生理前提[20, 23]。有研究表明，不育男性的精子质膜显著去极化与IVF周期中的低受精率密切相关。这种状况在相当比例的患者中存在，可能源于钾离子传导异常或内向电流增加，表明离子通道功能和膜电位调节存在缺陷，这是导致男性不育和IVF失败的关键因素[22]。在这项研究中，层次聚类分析的结果显示，去极化程度最高的患者组其IVF成功率最低。

所有这些研究都表明，精子Em的去极化与损害受精功能的相关缺陷密切相关。Em不仅仅反映了细胞的代谢状态，还作为一个电化学开关：当它保持在“去极化”状态时，预示着配子相互作用的功能失败。这些发现有助于巩固当前的认知，但由于每次射精之间Em值的个体间差异较大，将其作为预测性诊断标志物的临床应用仍然有限[39]。在这种情况下，Em更适合作为ART周期中评估精子受精能力的功能指标，因为它能更准确地反映精子在过程中的生理状态，并可作为IVF成功率的预后标志物。使用流式细胞术等技术测量Em可以为预测畸形精子样本的功能提供有效方法，从而克服传统精液分析的局限性。尽管我们的TLFC方法显示出潜力，但需要标准化Em评估协议以便在更广泛的临床应用中推广。此外，探索人工调节精子膜电位是否能够改善生育结果还有待进一步研究。本研究的局限性在于缺乏评估精子Em与男性因素关系的补充诊断方法。虽然我们的发现很有前景，但仍需要更大规模的队列研究来验证这些发现，并研究其他精子变化，特别是在特发性不育的情况下，以更好地定义Em在生殖医学中的潜在作用。