《Archives of Virology》：Rocio virus sustained circulation in Brazil: first infection case in a horse highlights the need for enhanced arbovirus surveillance
编辑推荐：
本研究为应对罗西奥病毒(Rocio virus, ROCV)在巴西长达数十年的“沉寂”后可能重新出现的公共卫生风险，开展了对一例马匹病毒性脑炎病例的深入研究。通过宏转录组测序等技术，研究人员首次从马中枢神经组织成功分离并获得ROCV全基因组序列，揭示了该病毒在长期隐匿传播中持续的遗传演化。此项发现证实了马匹可作为该神经嗜性病毒的重要哨兵动物，强调了将ROCV纳入常规监测体系的紧迫性。
提起巴西历史上最大规模的病毒性脑炎疫情，时间要回溯到20世纪70年代中期。在圣保罗州的沿海地区，一种名为罗西奥病毒(Rocio virus, ROCV)的新型病原体在1975年至1977年间引发了超过1000例脑炎病例，死亡率超过10%，幸存者中超过20%留下了永久性的神经系统后遗症，造成了严重的公共卫生危机。ROCV是一种由蚊虫传播的正黄病毒属(Orthoflavivirus)成员，具有嗜神经性。然而，在70年代的爆发后，这个病毒仿佛“人间蒸发”了一般，除了零星血清学阳性报告和2012-2013年通过分子生物学方法检测到的两例人感染外，再无明确的临床病例报告。这种长达近四十年的“沉寂”引发了科学家们的疑问：ROCV是真的消失了，还是仍在隐秘地传播？如果是后者，它又在以何种方式、在哪些宿主中循环？这些谜团使得追踪ROCV的踪迹、理解其进化动态成为一项紧迫的课题，对于预防其可能的再次暴发至关重要。
为了回答这些问题，一个研究团队在《Archives of Virology》上发表了一项突破性研究。他们报告了近四十年来全球首例罗西奥病毒感染的临床病例，而且病例宿主并非人类，而是一匹马。2013年2月，巴西巴拉那州的一匹5岁夸特马出现严重的神经系统症状，包括后肢瘫痪、角弓反张、前肢强直阵挛性发作和自残行为。这匹马最终被实施安乐死，其中枢神经系统(CNS)组织被送至诊断中心进行狂犬病检测。正是对这匹马组织的深入分析，意外地揭开了ROCV持续存在的面纱。
研究团队运用了几项关键的技术方法来揭示病毒的“真身”。首先，在排除了狂犬病后，他们尝试了病毒分离，利用BHK21、VERO、RK13等多种细胞系成功培养出病毒。接着，通过正黄病毒属(Orthoflavivirus)通用引物的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及随后的Sanger测序，初步鉴定出ROCV。最关键的一步是，研究人员对分离到的病毒株（编号EQ773/13）进行了宏转录组测序(Metatranscriptomics)，这是一种不依赖培养、直接对样本中所有RNA进行测序的技术，从而成功获得了该病毒株的完整基因组序列。最后，他们利用生物信息学方法，将新获得的基因组与历史上已有的ROCV毒株序列进行比对，构建系统发育树，并分析了其进化速率和基因突变情况。
研究结果揭示了以下几点重要发现：
- 1.
成功分离与鉴定：研究首次从一匹患有脑炎的马的中枢神经组织中成功分离出ROCV，并通过测序确证。这表明马匹不仅是ROCV的易感宿主，而且感染可导致致命的临床症状，推翻了此前认为马感染多为无症状或亚临床感染的观点。
- 2.
全基因组解析与系统发育定位：通过宏转录组测序，研究获得了毒株EQ773/13长达10,849个核苷酸的全基因组。系统发育分析显示，该毒株与ROCV参考株及伊柳病毒(Ilheus virus, ILHV)聚为一支，且同圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、西尼罗河病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)等重要嗜神经性黄病毒亲缘关系较近。这从基因组层面确认了其ROCV的身份。
- 3.
持续的遗传进化：与1975年的ROCV参考株相比，EQ773/13毒株积累了多达297个核苷酸突变。进化速率分析显示，其全基因组的进化速率估计在5.8–7.0 × 10?4替换/位点/年之间，这与正黄病毒属已知的进化速率一致，表明ROCV在过去四十年里并未停滞，而是在持续演化。
- 4.
关键蛋白突变：比较基因组学分析发现了31个氨基酸替换（非同义突变），其中包膜蛋白(Envelope Protein)的突变率最高（每个位点0.018），共有9个独特突变。包膜蛋白是病毒与宿主细胞相互作用、介导免疫反应的关键蛋白，其高频率突变可能对病毒的抗原性、毒力或传播能力产生影响。
- 5.
异常序列的启示：值得注意的是，分析发现2012-2013年从人类患者中检测到的三个ROCV序列与70年代的毒株异常相似，未表现出“时钟样”进化。当将这些序列从分析中剔除后，计算出的进化速率更符合其他正黄病毒的规律。这暗示这些后期人源毒株可能并非代表当时的主要流行谱系，或者存在其他复杂因素。
结论与意义：
这项研究有力地证明了罗西奥病毒在巴西并未消失，而是以“隐匿流行”的方式持续循环了数十年。从马匹中首次发现临床病例并获取病毒全基因组，具有里程碑式的意义。它揭示了马作为ROCV感染的重要哨兵动物的价值，其出现神经系统疾病可能预示着病毒在环境中的活动增强和向人群扩散的风险上升。研究所测算的进化速率和观察到的基因变异（尤其是包膜蛋白的突变）表明，病毒在长期隐匿传播中仍在不断适应和演化，这为其潜在的抗原性变化和致病性改变敲响了警钟。更重要的是，该研究凸显了当前基于症状（如登革热样症状）的监测体系可能存在漏洞，容易遗漏像ROCV这样的病原体。因此，研究者强烈呼吁应将ROCV的检测纳入巴西乃至更广泛地区的虫媒病毒常规基因组监测计划中，利用马匹等动物哨兵加强预警，以便在未来可能发生的疫情中实现早期发现、快速鉴定和及时干预，避免历史悲剧重演。这项工作为理解一种“消失”多年的病原体的生态学和进化提供了关键数据，也为新发传染病防控提供了重要的监测策略参考。
