《Molecular Biomedicine》：Structurally-optimised HPV16 E7/E6 mRNA–LPP mediates dose-sparing efficacy via tumour microenvironment reprogramming
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为解决HPV相关恶性肿瘤治疗性疫苗开发中肿瘤微环境(TME)免疫抑制及现有递送平台效力有限的挑战，研究人员开展了基于核心-壳结构脂质多聚复合物(LPP)递送系统的mRNA疫苗策略研究。他们系统比较了密码子与非翻译区(UTR)优化的非复制型mRNA(nr-mRNA)与自我扩增型mRNA(sa-mRNA)疫苗。结果显示，两种疫苗均能有效激活系统性抗肿瘤免疫应答，显著增强功能性CD8? T细胞和自然杀伤(NK)细胞浸润，并促使肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M1表型复极化。值得注意的是，sa-mRNA–LPP平台仅需五分之一nr-mRNA–LPP的剂量即可实现相当疗效，并显示出更强的局部免疫调节能力。该研究为靶向HPV相关癌症的LPP-mRNA疫苗临床转化提供了重要实验依据。
论文解读
宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，人乳头瘤病毒(HPV)感染是其主要病因。世界卫生组织(WHO)发起了消除宫颈癌的全球倡议，而开发针对HPV感染及相关癌前病变的治疗性疫苗，是中国等国战略规划的重要内容。尽管预防性HPV疫苗已取得巨大成功，但对于已感染的个体或已形成的肿瘤，治疗性疫苗的开发仍面临严峻挑战。这主要归因于肿瘤内部复杂而强大的免疫抑制微环境(Tumor Microenvironment, TME)，它像一个“铜墙铁壁”，能阻碍免疫细胞的攻击；同时，现有药物递送平台的效率也限制了疫苗效力的充分发挥。为了突破这些瓶颈，探索能够有效激活抗肿瘤免疫、并重塑免疫抑制微环境的新型疫苗策略，成为当前研究的前沿热点。针对此，一篇发表在《Molecular Biomedicine》上的研究论文，深入探索了基于mRNA（信使核糖核酸）技术平台的两种新型疫苗策略，为HPV相关癌症的治疗带来了令人鼓舞的新希望。
该研究运用了多项关键技术方法。核心是设计了两种基于核心-壳结构脂质多聚复合物(Lipopolyplex, LPP)递送系统的mRNA疫苗：一种是经过密码子和非翻译区(Untranslated Region, UTR)优化的非复制型mRNA(Non-replicating mRNA, nr-mRNA)；另一种是自我扩增型mRNA(Self-amplifying mRNA, sa-mRNA)，其基于委内瑞拉马脑炎病毒复制子系统，可在细胞内自我扩增，实现抗原的持续高表达。研究在TC-1小鼠（一种HPV16 E6/E7驱动的肿瘤模型）体内评估了疫苗的抗肿瘤疗效。通过一系列细胞和分子生物学技术，如蛋白质印迹法(Western Blot)分析抗原表达，流式细胞术(Flow Cytometry)全面分析肿瘤、脾脏、淋巴结中各类免疫细胞（如CD8? T细胞、自然杀伤细胞、调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞等）的浸润比例、表型和功能状态，酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测抗原特异性T细胞反应，以及免疫荧光显微术观察肿瘤组织内免疫细胞的空间分布，系统阐明了疫苗诱导的免疫应答机制。
研究结果
1. 设计并体外筛选具有优化结构稳定性和密码子使用率的nr-mRNA序列
研究人员首先设计并筛选了编码HPV16 E7/E6融合抗原的nr-mRNA序列。他们通过分析最小自由能和密码子适应指数等参数，筛选出M1和M2两个在体外表达水平高、结构稳定的候选序列。这些结果表明，对nr-mRNA的编码区进行结构稳定性和密码子使用率的联合优化，可以有效增强其蛋白质表达水平。
2. 先导nr-mRNA候选物的体内抗肿瘤功效
在TC-1荷瘤小鼠模型中，将M1和M2序列封装于LPP纳米颗粒中，进行单次皮下注射。结果显示，两种候选疫苗在5 μg和30 μg剂量下均能诱导强烈的剂量依赖性抗肿瘤反应，显著抑制肿瘤生长，且两者疗效无显著差异。因此，选择M1序列作为后续研究的先导候选物。
3. M1-LPP疫苗重塑肿瘤微环境
深入分析发现，M1-LPP疫苗能够显著改变肿瘤内部的免疫景观。疫苗注射后，肿瘤内CD45+白细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞浸润显著增加。更重要的是，功能性CD8+T细胞（分泌干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞）比例大幅提升。同时，疫苗还能重塑免疫抑制性的髓系细胞区室：高剂量(30 μg)的M1-LPP能显著减少肿瘤内总的CD11b+髓系细胞和髓源性抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs)，并促使肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages, TAMs)从促肿瘤的M2表型向抗肿瘤的M1表型复极化，从而逆转了肿瘤微环境的免疫抑制状态。
4. UTR优化增强nr-mRNA翻译效率
为了进一步提升疫苗效力，研究人员用已获批的mRNA疫苗BNT162b2的UTR序列替换了原有nr-mRNA的UTR，构建了B1和B2序列。结果显示，UTR优化能显著提高蛋白质的体外表达水平，其中B1序列的表达最高。这表明UTR的选择对mRNA的稳定性和翻译效率至关重要。
5. UTR优化使得低剂量即可实现强效抗肿瘤作用
在体内实验中，优化后的B1-LPP疫苗表现出更强的效力。单次5 μg剂量的B1-LPP所诱导的抗肿瘤活性，就与30 μg剂量的原始M1-LPP疫苗相当，且增加剂量至30 μg并未带来额外益处。这证明了UTR优化实现了显著的剂量节约效果。
6. 低剂量B1-LPP疫苗在肿瘤微环境内引发局部化抗肿瘤免疫
免疫表型分析发现，5 μg B1-LPP疫苗能特异性地增强肿瘤内NK细胞、CD8+T细胞及功能性CD8+T细胞的募集和激活，但这种强烈的免疫激活主要局限于肿瘤局部，在外周脾脏等器官并未检测到显著的抗原特异性T细胞反应。这凸显了该疫苗高效诱导局部抗肿瘤免疫的能力。
7. HPV16 E7E6在sa-mRNA构建体中的高效持续表达
研究人员还构建了基于委内瑞拉马脑炎病毒复制子的自我扩增型mRNA疫苗。体外实验证实，无论是裸露的SAM还是SAM-LPP，均能实现E7E6抗原的高水平、持续性表达，且表达水平在一定剂量范围内与剂量无关，这为低剂量免疫策略提供了基础。
8. 皮下注射SAM–LPP疫苗诱导更显著的抗肿瘤效果
比较不同给药途径发现，皮下注射SAM-LPP的抗肿瘤效果显著优于肌肉注射，皮下注射组达到了40%的完全缓解率。
9. 比较SAM–LPP和B1-LPP疫苗的抗肿瘤功效
剂量对比实验显示，SAM-LPP平台具有明显的剂量节约优势：1 μg剂量的SAM-LPP所达到的抗肿瘤效果，与5 μg剂量的优化版B1-LPP疫苗相当。
10. SAM–LPP疫苗引发局部化抗肿瘤免疫并重编程髓系区室
对SAM-LPP作用机制的剖析显示，该疫苗同样能强力激活肿瘤内的免疫应答，显著增加CD8+T细胞（包括E7特异性细胞）浸润和功能。特别值得注意的是，5 μg剂量的SAM-LPP还能显著降低肿瘤内调节性T细胞的比例，并提高CD8+T细胞与调节性T细胞的比值，同时促进TAMs向M1表型极化。与B1-LPP类似，SAM-LPP诱导的免疫反应也主要集中于肿瘤微环境，系统性免疫激活微弱。
11. SAM–LPP疫苗激活肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1轴
研究还发现，SAM-LPP疫苗接种后，肿瘤内的T细胞上PD-1表达上调，同时肿瘤细胞和MDSCs上的PD-L1表达也显著增加。这种PD-1/PD-L1轴的同步上调，提示疫苗诱导了“适应性免疫抵抗”机制，为联合使用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂以进一步增强疗效提供了理论依据。
研究结论与意义
该研究系统地设计、优化并比较了两种基于LPP递送系统的mRNA疫苗平台——结构优化的nr-mRNA和sa-mRNA。两种平台均能通过增强抗原特异性细胞免疫（特别是CD8+T细胞和NK细胞）和重编程肿瘤免疫微环境（减少免疫抑制细胞、促进M1型巨噬细胞极化），在HPV16驱动的肿瘤模型中产生强大的治疗效果。
本研究的核心发现和重要意义在于：第一，证明了联合优化策略的有效性。通过同步优化nr-mRNA的编码区结构（最小自由能、密码子适应指数）和非翻译区序列，可以协同提升其翻译输出和免疫原性，实现剂量节约。第二，明确了sa-mRNA平台的剂量节约优势。基于病毒复制子系统的sa-mRNA，凭借其自我扩增能力，能以低至传统nr-mRNA五分之一的剂量，实现同等的抗肿瘤疗效，这在降低生产成本、提高安全性方面具有巨大潜力。第三，揭示了局部化免疫激活的新机制。两种疫苗，尤其是优化后的版本，诱导的强效抗肿瘤免疫主要局限于肿瘤微环境内部，而非全身性过度激活，这提示了一种高效且可能更安全的治疗模式。第四，阐明了多重免疫调节作用。疫苗不仅能激活杀伤性免疫细胞，还能重塑肿瘤微环境，包括降低调节性T细胞比例、改变巨噬细胞极化状态等，从多个层面协同攻击肿瘤。第五，为联合治疗指明方向。疫苗诱导的PD-1/PD-L1轴上调，为将其与免疫检查点抑制剂联合使用，以克服免疫抵抗、实现协同增效提供了强有力的实验依据。
综上所述，这项研究不仅验证了LPP-mRNA疫苗平台在治疗HPV相关恶性肿瘤中的高效性，还深入阐释了其通过局部免疫重塑发挥强效、低剂量抗肿瘤作用的独特机制。这些发现为推进该类新型治疗性疫苗的临床转化，以应对宫颈癌等HPV相关疾病，提供了重要的理论和实验支撑。
