柑橘黄龙病病原体亚洲柑橘木虱的半胱氨酸组织蛋白酶DcCTSL1通过直接切割外膜蛋白BamD介导免疫防御

《Plant Biotechnology Journal》：Psyllid Cysteine Cathepsins Directly Cleave the Outer Membrane Protein BamD of Citrus Huanglongbing Pathogen

本综述揭示了一项重要突破：传播柑橘黄龙病（HLB）的媒介昆虫——亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）能够通过其半胱氨酸组织蛋白酶DcCTSL1，直接切割病原体“CandidatusLiberibacter asiaticus”（CLas）的关键外膜蛋白BamD，从而发挥免疫防御作用。该机制依赖DcCTSL1保守的催化三联体（Cys185, His325, Asn350），特异性识别并切割BamD的Ile145-Arg146位点。研究还发现柑橘宿主中的同源蛋白酶CsPLCP具有相似功能，表明这是一条在媒介昆虫和植物宿主间进化保守的防御通路。这项工作为开发基于蛋白酶的新型黄龙病防治策略提供了全新的理论依据。

　　

1 引言

柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB），又称柑橘黄龙病，是由韧皮部定殖细菌“CandidatusLiberibacter asiaticus”（CLas）引起的毁灭性病害，对全球柑橘产业构成严重威胁。该病原体主要由亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）以持久增殖型方式传播。当前，由于CLas难以培养及病害系统的复杂性，HLB的防控面临巨大挑战。以往研究多集中于开发植物源抗菌肽、噬菌体内溶素等植物层面的防控策略，而媒介昆虫先天免疫系统在限制CLas传播中的作用则相对未被充分探索。在木虱体内，CLas的持久传播涉及病原体与媒介之间复杂的互作，其过程包括在中肠的初始定殖、进入血淋巴的扩散以及最终入侵唾液腺。已知CLas能劫持木虱的细胞骨架蛋白以突破中肠屏障，同时也会触发木虱的免疫反应。近期研究强调了蛋白酶在动植物宿主-病原体互作中的重要性。组织蛋白酶（Cathepsins）是一类半胱氨酸蛋白酶，通过蛋白水解切割靶标蛋白发挥功能，其活性依赖于保守的催化三联体（Cys, His, Asn）。在柑橘中，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（Papain-like cysteine proteases, PLCPs）在CLas感染后上调并有助于宿主防御。然而，CLas也能分泌毒力因子抑制柑橘PLCP的活性。在昆虫媒介中，木虱的组织蛋白酶L（CTSL）是否能直接通过蛋白水解切割来降解CLas尚属未知。革兰氏阴性菌的外膜蛋白是抗菌干预的诱人靶点，其中BamD是β-桶状组装机制复合物的核心组分，对大多数革兰氏阴性菌的外膜蛋白折叠和插入至关重要且高度保守。本研究旨在探索木虱半胱氨酸组织蛋白酶是否以及如何作为免疫效应因子直接靶向CLas的外膜蛋白。

2 结果

2.1 DcCTSL1的鉴定及其与CLas外膜蛋白BamD的特异性互作

为探究亚洲柑橘木虱的DcCTSLs是否参与对CLas的免疫互作，研究通过生物信息学分析鉴定出9个编码CTSL的基因。与其它昆虫的CTSLs类似，DcCTSLs包含N端信号肽、自抑制前肽区域以及具有半胱氨酸蛋白酶特征性催化三联体（Cys, His, Asn）的C端Peptidase C1结构域。酶活检测表明，CLas感染后木虱体内总组织蛋白酶活性显著升高。向感染木虱体内显微注射组织蛋白酶抑制剂E64会降低酶活并增加CLas 16S rRNA水平，提示组织蛋白酶活性有助于防御CLas。通过RT-qPCR比较CLas感染与未感染木虱中CTSL基因的表达水平，发现DcCTSL1和DcCTSL2显著上调，其中DcCTSL1上调最显著，其蛋白酶前体（PreP，~40 kDa）和成熟蛋白酶（MP，~25 kDa）形式的蛋白水平也显著增加。利用RNAi敲低DcCTSL1表达会导致CLas积累显著增加、总组织蛋白酶活性降低以及受感染木虱的CLas传播效率增强，而敲低DcCTSL2无显著影响，这些结果证明DcCTSL1对木虱的抗CLas免疫至关重要。

DcCTSL1的无活性蛋白酶形式包含抑制因子结构域和Peptidase C1结构域，而其MP形式仅保留包含特征性催化三联体的Peptidase C1结构域。酶活实验证实纯化的DcCTSL1-MP具有高蛋白水解活性。考虑到半胱氨酸蛋白酶具有催化切割活性，研究以DcCTSL1为诱饵，对一组19个CLas膜相关蛋白进行了酵母双杂交筛选。在所有候选蛋白中，只有BamD与DcCTSL1，特别是与其成熟的Peptidase C1结构域发生互作。该互作进一步通过GST pull-down实验得到验证。免疫荧光标记显示，在未感染木虱的中肠细胞中，DcCTSL1呈细胞质分布；而在感染木虱的中肠细胞中，DcCTSL1大量富集并与CLas的BamD共定位。免疫电镜进一步显示，在感染木虱的中肠细胞中，BamD特异性定位于CLas细胞的膜上，而DcCTSL1则在CLas细胞和邻近的包涵体上均有检测到。BamD是参与细菌外膜完整性和组装的必需外膜蛋白。系统发育分析表明BamD在韧皮部限制性细菌中广泛保守。这些发现表明DcCTSL1直接结合CLas外膜蛋白BamD并有助于其抗菌活性。

2.2 DcCTSL1特异性切割CLas外膜蛋白BamD

接下来，研究探究了DcCTSL1的抗CLas免疫机制。向CLas感染木虱体内显微注射纯化的DcCTSL1-MP，会导致全长BamD条带（~30 kDa）减少，并出现一条更强的~18 kDa条带。相反，通过dsRNA敲低DcCTSL1表达则导致30 kDa条带强度增加，切割减少。免疫电镜也揭示，用DcCTSL1-MP处理感染木虱的中肠细胞后，细菌细胞膜受损。定量分析显示，DcCTSL1-MP处理导致约50%的CLas细胞膜受损，而BSA处理的对照组仅为约5%。鉴于DcCTSL1特异性结合CLas且其外源施用显著增加CLas膜损伤，研究得出结论：DcCTSL1与BamD的特异性互作导致膜破坏，这是其抗CLas活性的关键机制。

为深入研究DcCTSL1-MP如何直接切割BamD，将纯化的DcCTSL1-MP与BamD在37°C孵育4小时。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示30 kDa的BamD条带减少，并出现约18 kDa和12 kDa的两个切割产物，表明DcCTSL1-MP直接对BamD进行了蛋白水解切割。同样，在共表达DcCTSL1-MP和BamD的HEK-293T细胞中，Western blot分析显示随着DcCTSL1-MP积累水平升高，BamD切割增加。为确定精确切割位点，从SDS-PAGE胶上切下约12 kDa的C端片段，进行胰蛋白酶消化和质谱分析。来自切割产物的第一个可识别肽段表明切割发生在BamD的Arg¹⁴⁶和Asp¹⁴⁷之间。序列分析显示，R¹⁴⁶之前是一个疏水残基Ile¹⁴⁵，这与报道的半胱氨酸组织蛋白酶对P1位点为精氨酸、P2位点为疏水或芳香族残基的底物偏好一致。为进一步探究BamD中I¹⁴⁵、R¹⁴⁶和D¹⁴⁷在DcCTSL1-MP介导切割中的作用，在这些位点及相邻的Met¹⁴⁴处引入了丙氨酸取代。丙氨酸突变显示，I¹⁴⁵和R¹⁴⁶的取代完全消除了BamD的切割，而M¹⁴⁴或D¹⁴⁷的突变则没有影响。这些结果证明BamD中的I¹⁴⁵和R¹⁴⁶是DcCTSL1识别底物的关键，蛋白水解切割特异性地发生在R¹⁴⁶和D¹⁴⁷之间。

序列比对揭示了IR基序在不可培养的Liberibacter物种BamD蛋白中的保守性，而在可培养的Liberibacter crescensBamD中该基序缺失。值得注意的是，利用AlphaFold3进行的结构预测表明，CLas BamD的I¹⁴⁵和R¹⁴⁶残基位于暴露在蛋白质表面的柔性连接区，提示它们可能作为蛋白酶切割位点而被访问。因此，研究得出结论：DcCTSL1通过特异性蛋白-蛋白互作靶向BamD，随后识别表面暴露的IR基序，并切割IR基序的R¹⁴⁶与下游D¹⁴⁷残基之间的肽键。

2.3 DcCTSL1切割BamD依赖其保守的催化三联体

半胱氨酸组织蛋白酶的酶活依赖于由Cys、His和Asn组成的保守催化三联体。作为该家族成员，DcCTSL1包含特征性的三联体残基C¹⁸⁵、H³²⁵和N³⁵⁰。为确定DcCTSL1介导的BamD切割是否需要此三联体，研究构建了丙氨酸取代突变体。所有纯化的突变体蛋白在体外均显示出比野生型显著降低的酶活。随后，将每种纯化的DcCTSL1-MP突变体显微注射到CLas感染木虱体内。Western blot分析显示，与注射野生型DcCTSL1-MP的木虱相比，突变体处理组中~30 kDa的全长BamD条带更强，而~18 kDa的切割片段更弱。此外，当在HEK-293T细胞中与BamD共表达时，野生型DcCTSL1-MP能有效切割BamD，而所有三个催化三联体突变体均丧失了此能力。为表征DcCTSL1的酶学特性，系统评估了pH对其切割底物BamD的蛋白水解活性的影响。在pH梯度从3.5到11.5的缓冲液中，将纯化的重组DcCTSL1-MP与BamD在37°C孵育4小时。对切割产物的定量分析显示，DcCTSL1-MP在pH 5.5时表现出最大的蛋白水解活性。在酸性（pH 3.5）和近中性（pH 7.5）条件下也保留了显著活性，而在碱性条件下（pH 9.5和11.5）则几乎观察不到切割。这些结果表明，DcCTSL1介导的对CLas外膜蛋白BamD的切割功能上依赖于其保守的催化三联体。这种蛋白水解活性破坏了细菌膜的完整性，最终遏制了CLas的增殖。

2.4 DcCTSL1在柑橘植株中赋予对CLas的抗性

为评估DcCTSL1对HLB的抗菌功效，首先通过农杆菌介导的瞬时表达在CLas感染柑橘植株的叶片中表达DcCTSL1-MP。qPCR和Western blot分析显示，与对照相比，表达DcCTSL1-MP的叶片中CLas滴度显著降低，CLas外膜蛋白Barrel和BamD水平下降，BamD切割产物积累增加。这可能意味着DcCTSL1破坏了CLas膜的完整性并诱导了细胞裂解效应。

为稳定表达DcCTSL1，通过发根农杆菌介导的转化，利用CLas感染柠檬枝条的茎段产生了转基因根。通过GUS染色和Western blot验证了转基因根。qPCR分析显示，与空载对照相比，过表达DcCTSL1的根中CLas滴度显著降低。与此结果一致，Western blot分析显示过表达DcCTSL1的根中Barrel和BamD水平降低，同时BamD切割增加。这些结果表明，异源表达DcCTSL1能有效抑制植株体内的CLas感染。

接下来，研究生产并纯化了重组DcCTSL1-MP蛋白以评估其用于HLB防控的潜力。植物毒性测试表明，即使在高浓度下，将DcCTSL1-MP注射到柑橘叶片中也未造成可见损伤。为评估其保护功效，将DcCTSL1-MP或作为对照的BSA注射到CLas感染甜橙树的茎干中。注射后两个月，用DcCTSL1-MP处理的树生长改善，且与CLas滴度持续增加的BSA注射对照相比，其CLas滴度显著降低。总之，通过多种实验方法，包括瞬时表达、稳定根转化和直接蛋白施用，研究证明DcCTSL1在柑橘植株中发挥强大的抗CLas活性，突显了其作为HLB管理治疗剂的潜力。

2.5 甜橙半胱氨酸蛋白酶CsPLCP切割BamD并赋予对CLas的抗性

基于半胱氨酸蛋白酶在哺乳动物、昆虫和植物中的高度保守性，以及现有证据表明柑橘PLCPs有助于对CLas的免疫反应，研究探讨了甜橙CsPLCP是否也通过蛋白水解切割CLas BamD来赋予抗CLas活性。值得注意的是，CsPLCP和DcCTSL1具有保守的催化残基，它们的成熟蛋白酶结构域具有58%的氨基酸序列同一性。对总CsPLCP活性的测量显示，与健康对照相比，CLas感染柑橘叶片中的活性被显著诱导。CsPLCP的转录水平在CLas感染后上调。相应地，其蛋白酶前体和成熟蛋白酶形式的蛋白水平均增加，同时伴有BamD切割产物的积累，表明在柑橘响应CLas感染时也发生了BamD的蛋白水解加工。

利用酵母双杂交实验，证实了全长CsPLCP及其成熟形式均与BamD互作。为确定植株体内的空间关系，对CLas感染柑橘叶片组织进行了免疫电镜观察。结果显示，在感染韧皮部组织内，CsPLCP和BamD特异性定位于CLas细胞膜周围。CsPLCP包含保守的催化三联体残基C¹⁵²、H²⁸⁶和N³⁰⁷。为评估BamD的蛋白水解切割是否依赖此催化三联体，构建了丙氨酸取代突变体。在HEK-293T细胞中共表达野生型CsPLCP-MP与BamD导致有效切割，而所有三个催化突变体均丧失了此蛋白水解活性，证明CsPLCP介导的切割严格依赖于其功能性催化三联体。

为比较木虱蛋白酶DcCTSL1和柑橘蛋白酶CsPLCP在切割BamD和抑制CLas方面的活性，首先测量了它们各自重组MP结构域的蛋白酶活性。在相同浓度下，DcCTSL1-MP在体外表现出比CsPLCP-MP更高的蛋白水解活性。当与BamD在37°C孵育4小时，两种蛋白酶都切割了BamD，不过DcCTSL1-MP显示出更强的切割活性。通过农杆菌浸润在CLas感染柑橘植株叶片中瞬时表达两种蛋白酶，进一步评估了CsPLCP-MP的抗CLas能力并与DcCTSL1-MP进行了比较。qPCR分析显示，表达CsPLCP-MP显著降低了CLas滴度，而DcCTSL1-MP导致更大幅度的降低。与此一致，两种蛋白酶都降低了CLas外膜蛋白Barrel和BamD的积累，并增加了BamD切割产物的水平。然而，与qPCR结果相对应，DcCTSL1-MP的表达导致比CsPLCP-MP更低的总体CLas膜蛋白水平和更丰富的BamD切割产物。这些结果表明，CsPLCP和DcCTSL1都通过切割BamD发挥抗CLas活性，其中DcCTSL1表现出更强的蛋白酶活性和对CLas更大的抑制作用。

3 讨论

对抗HLB的持续斗争推