《Advanced Science》：Oral Streptococcus salivarius Couples Neutrophil IRGM1 Signaling to NET Formation and Colorectal Cancer Metastasis
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本研究揭示口腔共生菌唾液链球菌（S. salivarius）是结直肠癌（CRC）转移的关键驱动因素。研究发现S. salivarius可在CRC患者的舌苔、粪便及肿瘤微环境（TME）中富集，并通过激活中性粒细胞中的IRGM1-IQGAP1/Wnt5a-PI3K/AKT信号通路，诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，进而重塑肿瘤免疫微环境，促进CRC细胞迁移和远处肺转移。该研究为理解口腔微生物通过“口-肠轴”调控肿瘤转移提供了新机制，提示IRGM1信号轴或成为抑制CRC转移的潜在治疗靶点。
引言：探索口腔微生物在结直肠癌转移中的作用
尽管诊疗手段不断进步，远处转移仍是导致结直肠癌（CRC）患者死亡的主要原因。近年来，肿瘤微环境（TME）和肠道微生物群在转移中的作用日益受到关注，但起源于口腔的细菌是否以及如何通过免疫重编程影响CRC转移，其机制尚不完全清楚。本研究聚焦于口腔共生菌唾液链球菌（S. salivarius），旨在揭示其通过调控中性粒细胞免疫反应促进CRC转移的分子机制。
临床与微生物谱分析：鉴定口腔来源的S. salivarius为CRC相关细菌
研究首先通过收集CRC患者及健康对照的舌苔样本，以及治疗前CRC患者的肿瘤及配对癌旁组织，进行了多部位微生物组分析。16S rRNA测序结果显示，CRC患者的舌苔菌群与健康对照存在明显差异，其中链球菌属（Streptococcus）在CRC患者舌苔中显著富集。进一步在物种水平分析发现，唾液链球菌（S. salivarius）在肿瘤组织中的丰度显著高于配对癌旁组织。对CRC患者粪便样本的分析也证实了链球菌属的富集，且定量PCR显示S. salivarius的mRNA水平在CRC患者中显著升高。荧光原位杂交（FISH）结果进一步验证，与癌旁组织相比，肿瘤组织中S. salivarius信号增强。此外，临床相关性分析发现，S. salivarius的丰度与肿瘤负荷、淋巴结转移等临床指标呈正相关。这些多平台数据一致表明，S. salivarius在CRC患者的口腔、粪便和肿瘤相关生态位中持续富集。
中性粒细胞是S. salivarius驱动CRC进展的关键介质
在功能验证前，研究团队在体外培养了S. salivarius并确定了其最佳感染复数（MOI=100）。随后，利用皮下CT26肿瘤小鼠模型，研究者发现口服S. salivarius可显著增加小鼠的肿瘤负荷。对肿瘤组织的转录组分析显示，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成相关通路被显著富集。流式细胞术分析证实，S. salivarius处理组小鼠的外周血和肿瘤组织中Ly6G+CD11b+中性粒细胞显著增多，而其他免疫细胞群如CD4+/CD8+T细胞、巨噬细胞等则无显著变化，表明S. salivarius暴露可选择性诱导中性粒细胞在体内积累。
口腔S. salivarius促进CRC细胞迁移和远处转移
为探究S. salivarius是否直接影响CRC细胞的转移行为，研究进行了细胞功能实验。CCK-8增殖实验表明，S. salivarius在不同MOI下对多种CRC细胞系的增殖无显著影响。然而，Transwell迁移实验显示，S. salivarius能以剂量依赖的方式显著增强Difi和SW480细胞的迁移能力。在实验性肺转移模型中，通过尾静脉注射CT26-luc细胞建立小鼠模型，并每日口服S. salivarius。活体生物发光成像显示，与对照组相比，S. salivarius处理组小鼠肺部的转移信号随时间显著增强，肺部转移结节数量增多，H&E染色也证实了更广泛的转移性病灶。这些发现表明，S. salivarius能够选择性地增强CRC细胞的迁移能力，并在体内促进远处转移定植。
NETs形成与S. salivarius诱导的CRC转移相关
为评估S. salivarius诱导的中性粒细胞活化是否促进CRC细胞迁移，研究者建立了Transwell共培养体系。结果显示，经S. salivarius刺激的中性粒细胞可显著增强CRC细胞的迁移，而用DNA酶I（DNase I）降解NETs的DNA骨架可部分减弱此效应。蛋白质印迹和qRT-PCR分析证实，S. salivarius刺激可显著上调中性粒细胞中瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）以及髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）等NET相关标志物的表达，DNase I处理可抑制这些诱导。体内外免疫荧光染色也观察到，S. salivarius处理组中，肿瘤组织内存在大量citH3+/Ly6G+的NETs结构，且与肿瘤细胞密切关联。这些数据表明，S. salivarius能强力激活中性粒细胞形成NETs，从而促进CRC细胞的迁移和转移表型。
中性粒细胞中的Irgm1是S. salivarius诱导CRC转移的关键分子介质
转录组分析发现，免疫相关GTP酶M1（IRGM1）是CRC肿瘤组织中上调最显著的基因之一。在体外，S. salivarius刺激可显著诱导小鼠骨髓来源中性粒细胞中Irgm1的表达。免疫组化（IHC）分析也证实，CRC患者肿瘤组织中IRGM1蛋白水平高于癌旁组织。为探究Irgm1的功能，研究者构建了中性粒细胞特异性Irgm1条件性敲除（Irgm1-cKO）小鼠。在肺转移模型中，虽然S. salivarius在野生型（WT）和Irgm1-cKO小鼠肠道内定植水平相当，但Irgm1-cKO小鼠的肺转移负荷相较于WT小鼠显著降低。这证明中性粒细胞中的Irgm1是S. salivarius诱导CRC转移所必需的。
S. salivarius通过IRGM1-IQGAP1-Wnt5a信号轴诱导中性粒细胞形成NETs
机制上，研究通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）、分子对接和邻近连接实验（PLA）发现，IRGM1与含有IQ基序的GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）存在物理相互作用并形成稳定复合物。转录组分析表明，Irgm1缺失会导致中性粒细胞中Wnt通路相关基因协同下调。qPCR筛选发现，S. salivarius可选择性上调Wnt家族中的Wnt5a表达。蛋白质印迹分析证实，S. salivarius刺激可增加IQGAP1和WNT5a的蛋白水平，并激活下游的PI3K/AKT信号通路。功能上，S. salivarius可增强中性粒细胞的迁移能力并提高NETs标志物水平。使用Wnt通路抑制剂XAV-939处理可抑制S. salivarius诱导的citH3表达，而激活剂LiCl则可部分挽救Irgm1缺失中性粒细胞中NETs形成的缺陷。这些结果支持了一个模型：S. salivarius通过激活中性粒细胞中的IRGM1-IQGAP1-Wnt5a-PI3K/AKT信号轴来促进NETs形成。
S. salivarius通过激活中性粒细胞IRGM1-IQGAP1-WNT5轴重塑肿瘤微环境
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，S. salivarius处理显著改变了肿瘤免疫微环境的细胞异质性，并上调了包括Cxcl2、S100a8、Irgm1在内的炎症和信号相关基因。对不同小鼠肿瘤模型（皮下瘤、肺转移瘤、原位CRC瘤）的免疫荧光分析发现，S. salivarius处理均能增加肿瘤组织中CD11b+髓系细胞的浸润，并增强Wnt5a、Iqgap1和Irgm1的荧光信号强度，表明IRGM1-IQGAP1-WNT5信号轴在体内被激活。此外，在肿瘤组织和S. salivarius处理的小鼠中，上皮-间质转化（EMT）相关标志物和NETs蛋白的表达也发生了相应改变。这些数据表明，S. salivarius通过激活中性粒细胞的IRGM1-IQGAP1-WNT5信号轴，重塑了CRC肿瘤微环境，并与促转移表型相关。
讨论与展望
本研究从临床观察出发，揭示了口腔共生菌S. salivarius在CRC患者多个部位富集，并与肿瘤进展和转移相关。研究阐明了一条由S. salivarius触发、经IRGM1-IQGAP1复合物介导、激活Wnt5a-PI3K/AKT信号、最终导致NETs形成和CRC转移的完整分子通路。这不仅为理解“口-肠轴”在癌症转移中的作用提供了新的机制见解，也提示靶向IRGM1-Wnt-NETs信号轴或可成为抑制CRC转移的新策略。此外，S. salivarius作为潜在的非侵入性生物标志物，或有助于识别具有高转移风险的CRC患者，为迈向微生物组导向的精准肿瘤学提供了新方向。
