《Advanced Science》：Loss of VMP1 Impairs Tight Junction Recycling and Aggravates Intestinal Barrier Dysfunction in Inflammatory Bowel Disease
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本期研究聚焦炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）中肠道上皮屏障功能障碍的新机制。研究发现，液泡膜蛋白1（VMP1）在IBD中显著下调，其缺失会破坏紧密连接（Tight Junction, TJ）完整性，加剧肠道炎症。机制上，VMP1通过招募CORO1C至晚期内体，促进Retromer复合物介导的TJ蛋白Occludin回收至质膜。VMP1功能缺失将导致Occludin转而被ESCRT依赖的微自噬降解，从而造成持续的TJ丢失。该研究揭示了VMP1是上皮紧密连接再循环和屏障稳态的一个关键调节因子，为IBD的发病机制提供了新见解，并为恢复肠道屏障功能提示了潜在的治疗靶点。
VMP1是炎症性肠病的关键关联基因
为了识别参与炎症性肠病发病机制的关键基因，研究团队对来自IBD患者和健康对照者的结肠及回肠组织的基因表达谱进行了分析。通过整合多种生物信息学方法，包括支持向量机递归特征消除、加权基因共表达网络分析、差异表达基因分析、非负矩阵分解、极端梯度提升和SHAP分析，最终筛选出一组高可信度的候选基因。其中，VMP1被确定为19个核心失调基因之一。单细胞转录组数据分析进一步显示，VMP1的表达在疾病进展的拟时序轨迹中呈现显著下降趋势。临床样本验证证实，VMP1的mRNA和蛋白水平在IBD患者结肠组织中均显著下调，且其表达量与疾病严重程度评分（Mayo评分）呈强负相关。功能富集分析提示，VMP1表达水平的变化与白细胞介导的免疫和屏障功能相关通路密切相关。这些结果共同将VMP1确立为IBD发病中的一个关键基因，其可能通过调节上皮屏障功能参与疾病进程。
VMP1缺失不加剧DSS诱导的体内IBD表型
为了探究VMP1下调在IBD发生发展中的作用，研究使用了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型。结果发现，在肠道上皮细胞特异性敲除Vmp1（Vmp1ΔIEC）的小鼠中，与对照Vmp1f/f小鼠相比，体重变化、结肠长度、疾病活动指数评分以及组织病理学损伤均无显著差异。然而，体外功能实验揭示了屏障功能的缺陷。源自Vmp1ΔIEC小鼠的小肠类器官在DSS处理后，其荧光素钠通透性在早期（6小时和12小时）显著增加，而其单层细胞培养物的跨上皮电阻在DSS处理后降低。在Caco-2细胞中敲低VMP1也观察到类似的早期屏障功能损伤。研究认为，体内表型不显著的原因可能是DSS引起的广泛上皮细胞凋亡掩盖了VMP1缺失特异性导致的旁细胞通透性变化。这表明，需要一种不引起大量细胞死亡的刺激来更精确地研究VMP1在屏障功能中的作用。
VMP1缺失加剧大肠杆菌诱导的紧密连接完整性破坏
研究进一步筛选了多种刺激物，发现大肠杆菌感染是研究旁细胞通透性调节的更适宜模型。在感染后，Vmp1ΔIEC类器官和VMP1敲低的Caco-2细胞的荧光素钠（4 kD）通透性显著增加，跨上皮电阻显著降低，而对70 kD右旋糖酐的通透性无影响，说明通透性增加是选择性的。透射电镜分析显示，VMP1缺失的Caco-2细胞在大肠杆菌刺激后，其紧密连接结构出现明显破坏，包括结构不连续、细胞间隙增宽以及总长度缩短。同时，在大肠杆菌的外膜囊泡可被观察到在细胞连接处聚集。免疫荧光分析证实，在大肠杆菌刺激下，VMP1缺失的Caco-2细胞、小鼠结肠组织和类器官中，紧密连接关键跨膜蛋白Occludin在细胞连接处的富集减少，并弥散分布至细胞质。而粘附连接蛋白E-cadherin的表达和定位未受影响。这些结果表明，VMP1对于维持紧密连接完整性具有关键作用，其影响具有选择性。
上皮特异性缺失VMP1加剧大肠杆菌诱导的肠道炎症
通过建立小鼠大肠杆菌感染模型，研究评估了VMP1在感染性结肠炎中的作用。结果显示，与Vmp1f/f小鼠相比，Vmp1ΔIEC小鼠表现出更显著的体重下降、结肠缩短、更高的疾病活动指数评分和组织病理学损伤。结肠镜检查也证实了更严重的结肠损伤。血清学分析显示，Vmp1ΔIEC小鼠的血清白蛋白降低，而内毒素和D-乳酸水平升高。体内通透性实验表明，感染后，Vmp1ΔIEC小鼠血清中荧光标记的右旋糖酐水平显著增高，表明肠道渗漏加剧。免疫荧光显示结肠组织中脂多糖沉积增加，细菌培养证实脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中的菌落形成单位显著升高，说明细菌易位增强。此外，Vmp1ΔIEC小鼠结肠组织中促炎细胞因子白介素-1β、肿瘤坏死因子-α和白介素-6的表达水平也显著上调。这些发现综合表明，肠道上皮VMP1的缺失通过破坏屏障完整性，显著加重了大肠杆菌诱导的结肠炎。
VMP1缺失促进ESCRT介导的Occludin微自噬降解
机制探索发现，在大肠杆菌刺激下，VMP1缺失显著降低了Occludin的蛋白水平，而对ZO-1和Claudin-1的表达影响较小。Ocln的mRNA水平无变化，提示是转录后调控。蛋白稳定性实验表明，VMP1缺失显著缩短了Occludin的半衰期。溶酶体抑制剂氯喹可抑制Occludin的降解，而蛋白酶体抑制剂MG132无效，说明降解通过溶酶体途径。进一步研究发现，巨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤无效，而敲低微自ophagy关键蛋白STIP1和HSPA8可恢复Occludin表达。敲低内体分选复合物（ESCRT）核心组分TSG101也能减少降解。免疫共沉淀和免疫荧光证实Occludin与ESCRT相关蛋白HGS存在相互作用并在VMP1缺失细胞中空间共定位增加。此外，抑制泛素激活酶可抑制降解。这些证据表明，在VMP1缺失时，Occludin被泛素化，并通过ESCRT依赖的微自噬途径降解。然而，有趣的是，尽管通过抑制该降解途径恢复了Occludin蛋白水平，透射电镜显示细胞间隙仍增宽，屏障通透性也未得到改善。这提示Occludin降解可能是一个终末事件，VMP1可能调控着更上游的、决定Occludin功能定位的关键过程。
VMP1调节Retromer依赖的Occludin再循环
研究转而关注Occludin的膜运输过程。表面生物素化实验表明，VMP1缺失并不影响Occludin的内吞，但显著损害了其从细胞内区室再循环回质膜的过程。流式细胞术也证实，感染后VMP1缺失细胞膜表面的Occludin水平显著降低。通过敲低不同再循环通路的关键蛋白，发现只有敲低Retromer复合体核心组分VPS35会损害Occludin再循环，而敲低RAB4A或RAB11A无效。免疫共沉淀和免疫荧光证实了Occludin与VPS35的相互作用和空间共定位。然而，VMP1缺失并不影响Retromer组分（VPS26A, VPS29, VPS35）的表达、复合体组装或稳定性。使用Retromer稳定剂TPT-260处理，能在对照细胞中轻微增强Occludin表达并改善屏障功能，但在VMP1缺失细胞中无效。这些结果表明，VMP1调控Occludin的再循环不依赖于Retromer的表达或稳定性，而是可能影响Retromer功能的某个关键步骤。
VMP1通过调节CORO1C定位调控Retromer介导的Occludin再循环
为了探究VMP1如何影响Retromer功能，研究关注了膜分裂过程，这是货物从晚期内体出芽所必需的。在VMP1缺失细胞中，Occludin与膜分裂位点的共定位减少，且在晚期内体区室中积累增加。通过免疫共沉淀结合质谱分析，鉴定出CORO1C是VMP1的潜在相互作用蛋白。CORO1C已知在膜分裂晚期被招募至内质网接触位点以支持Retromer介导的再循环。实验证实了VMP1与CORO1C的相互作用，且敲低CORO1C会损害Occludin再循环和屏障功能。VMP1缺失不影响CORO1C的总蛋白量，但活细胞成像显示，VMP1缺失严重削弱了CORO1C向晚期内体的招募。蛋白对接模拟和截短体实验表明，CORO1C的WD6结构域与VMP1的第99-109位氨基酸区域对两者相互作用至关重要。功能拯救实验证明，回补野生型VMP1或CORO1C能恢复Occludin再循环和屏障功能，而回补缺失关键相互作用结构域的突变体则无法实现拯救。
结论与展望
本研究通过整合生物信息学分析与实验验证，首次揭示了VMP1在炎症性肠病肠道屏障功能障碍中的关键作用。VMP1在IBD患者组织中下调，与疾病严重程度相关。功能上，VMP1缺失通过损害CORO1C向晚期内体的招募，破坏了Retromer复合物介导的紧密连接蛋白Occludin的再循环通路，导致Occludin被错误地导向ESCRT依赖的微自噬降解途径。这一过程最终造成紧密连接结构破坏、上皮通透性增加和肠道炎症加剧。这项研究不仅拓展了VMP1的已知生物学功能，为理解IBD中上皮屏障失调的分子机制提供了新的视角，也提示靶向VMP1-CORO1C-Retromer轴可能是恢复肠道屏障功能、治疗IBD的一个有前景的新策略。未来在自发性结肠炎模型中的研究将有助于进一步验证VMP1在不同病理环境中的作用。
