《Advanced Science》：DADA Enhances CD8+ T Cell Stemness to Improve Anti-Tumor Immunity and Immunotherapy Efficacy
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本研究揭示了药物DADA通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK1），增强CD8+T细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）和线粒体适应性，从而维持其干细胞样特性（Tpex细胞），阻止其向终末耗竭（Tex细胞）分化。这显著增强了抗肿瘤免疫反应，并与PD-1阻断疗法（ICB）和过继性T细胞转移（ACT）/CAR-T疗法产生了协同增效作用，为改善肿瘤免疫治疗提供了新的代谢干预策略。
引言：T细胞耗竭与干细胞样T细胞
CD8+T细胞是抵抗癌症的关键免疫细胞，但持续暴露于肿瘤抗原会导致其功能耗竭。在肿瘤微环境中，存在两种功能状态不同的耗竭CD8+T细胞亚群：终末耗竭T（Tex）细胞和祖源耗竭T（Tpex）细胞。Tex细胞高表达PD-1、TIM-3等多种抑制性受体，效应功能低下，对免疫检查点阻断（ICB）疗法反应不佳。相反，Tpex细胞具有干细胞样特性（通常表现为TCF1+TIM-3-表型），能够自我更新并分化为效应细胞，是介导持久抗肿瘤免疫反应、并对ICB和过继性细胞治疗（ACT）产生应答的关键细胞群。细胞代谢，特别是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），在维持Tpex细胞的干性和长期增殖潜能中起着核心作用。因此，探索能够调控CD8+T细胞代谢、增强其干性的策略，对于改善免疫治疗疗效具有重要意义。二异丙胺二氯乙酸盐（DADA）是丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）的有效抑制剂，临床长期用作保肝药，安全性良好。尽管已知DADA能通过抑制糖酵解抑制肿瘤细胞生长，但其对CD8+T细胞代谢、干性及抗肿瘤免疫功能的影响尚不明确。
DADA通过增强CD8+T细胞功能抑制肿瘤生长
研究人员首先在B16-F10黑色素瘤、MC38结肠癌皮下移植瘤以及B16-F10肺转移瘤等多种小鼠模型中评估了DADA的体内抗肿瘤效果。他们发现，无论是从接种肿瘤前两周开始持续给药，还是仅在接种前进行预处理，口服DADA均能显著抑制肿瘤的生长和转移，并且对小鼠表现出良好的安全性。进一步的机制探索表明，DADA的抗肿瘤效果依赖于CD8+T细胞。在DADA处理的荷瘤小鼠体内，肿瘤浸润CD8+T细胞的数量显著增加，并且这些细胞产生效应细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）和颗粒酶B（GZMB）的能力也更强。当通过抗体清除CD8+T细胞后，DADA的抑瘤作用完全消失，而清除CD4+T细胞或NK细胞则不影响其效果。这些结果表明，DADA是通过增强宿主CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答来发挥作用的。
DADA阻止CD8+T细胞终末耗竭并促进Tpex细胞积累
为了深入理解DADA如何增强CD8+T细胞功能，研究人员对MC38荷瘤小鼠肿瘤中的免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析发现，DADA处理显著富集了肿瘤微环境中的CD8+T细胞，并且这些细胞的基因表达谱显示与T细胞激活和分化相关的通路上调。通过对CD8+T细胞进行亚群细分，他们发现DADA处理导致终末耗竭CD8+T细胞比例呈下降趋势，而增殖性CD8+T细胞比例上升。这一发现在蛋白层面得到了验证。流式细胞术分析显示，DADA处理显著降低了肿瘤和引流淋巴结中CD8+T细胞中PD-1+TIM-3+和TCF1-TIM-3+的Tex细胞亚群比例，同时增加了干细胞样TCF1+TIM-3-的Tpex细胞亚群比例。此外，DADA还降低了耗竭关键转录因子TOX的表达，并提高了增殖标志物Ki67的表达。这些数据共同表明，DADA能够引导CD8+T细胞向更少的终末耗竭和更多的干细胞样状态分化。
DADA以PDK1依赖性方式增强CD8+T细胞干性
为了确认DADA是否直接调控CD8+T细胞的耗竭分化，研究人员在体外用抗CD3/CD28抗体持续刺激小鼠脾脏来源的CD8+T细胞，模拟耗竭过程。在刺激过程中加入DADA后，他们观察到类似的现象：Tex细胞比例下降，Tpex细胞比例以及干性相关标志物Ly108的表达上升，同时TNF-α和IFN-γ的产生增加。值得注意的是，DADA在短期（24或48小时）刺激中会抑制效应因子的产生，这说明其在慢性刺激模型中促进的细胞因子增加，是其减少终末耗竭的结果，而非直接增强早期效应功能。在抗原特异性OT-1 CD8+T细胞以及人外周血CD8+T细胞的体外实验中，DADA同样表现出促进干细胞样表型（如增加CD62L+CCR7+亚群）、减少耗竭标志物的作用。进一步的RNA测序分析证实，DADA处理的CD8+T细胞中，与干性和效应功能相关的基因（如Tcf7, Ifng）表达上调，而与终末耗竭相关的基因（如Tox）表达下调。DADA是PDK的抑制剂。在四种PDK同工酶中，RNA-seq数据显示Pdk1在耗竭CD8+T细胞中高表达，且能被DADA下调。通过CRISPR-Cas9技术敲低Pdk1，能够模拟DADA的效果，即减少耗竭、增强干性和细胞因子产生；而在Pdk1敲低的细胞中，DADA无法再产生额外增益。相反，敲低Pdk2、Pdk3或Pdk4则无此效应。这些结果证明，DADA是通过靶向PDK1来增强CD8+T细胞干性的。
DADA触发的代谢重编程促进CD8+T细胞干性
PDK1通过磷酸化抑制丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的活性，而PDC负责将丙酮酸不可逆地转化为乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），这是连接糖酵解与三羧酸循环（TCA）及后续OXPHOS的关键步骤。抑制PDK1应能促进这一代谢流。实验证实，DADA处理确实提高了CD8+T细胞内Acetyl-CoA的水平。通路富集和基因集富集分析（GSEA）均显示，DADA处理显著富集了OXPHOS、mTOR信号和碳代谢等通路。qPCR检测发现OXPHOS相关基因（如Cox5a）表达上调。Seahorse能量代谢分析进一步提供了直接证据：DADA处理显著提高了CD8+T细胞的耗氧率（OCR），包括基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力，表明OXPHOS增强。值得注意的是，DADA对细胞的糖酵解（通过细胞外酸化率ECAR测量）影响甚微。线粒体是OXPHOS的场所，其功能状态至关重要。DADA处理改善了CD8+T细胞的线粒体适应性，表现为线粒体膜电位和线粒体质量的增加，以及线粒体活性氧（ROS）产生的减少。这种代谢改善也在OT-1细胞和人CD8+T细胞中得到验证。为了确认增强的OXPHOS是DADA促进干性的原因，研究人员使用了OXPHOS抑制剂寡霉素。当寡霉素阻断OXPHOS后，DADA在减少耗竭、增强干性和改善线粒体功能方面的所有有益效应都被抵消。相反，直接给细胞补充Acetyl-CoA可以模拟DADA的效应，并且联合使用Acetyl-CoA和DADA没有叠加效果。此外，使用UK5099阻断线粒体丙酮酸载体（MPC），从而阻止丙酮酸进入线粒体，同样废除了DADA的作用。这些数据共同阐明了一条清晰的机制通路：DADA通过抑制PDK1，促进丙酮酸向Acetyl-CoA转化，从而增强OXPHOS和线粒体适应性，最终维持了CD8+T细胞的干细胞样特性。
DADA提升ACT和ICB免疫治疗疗效
由于Tpex细胞是响应过继性细胞治疗（ACT）和ICB疗法的关键群体，研究人员评估了DADA对这两种主流免疫疗法的增效作用。在ACT模型中，他们将经过DADA体外处理的OT-1 CD8+T细胞过继转移给MC38-OVA荷瘤小鼠。与对照组细胞相比，DADA处理过的OT-1细胞表现出更强的体内抗肿瘤活性，能更有效地控制肿瘤生长。这些细胞在受体小鼠的肿瘤微环境中数量更多，增殖（Ki67+）更活跃，并且保持了更高的Tpex细胞比例和更强的效应因子分泌能力，表明其体内持久性和抗肿瘤功能更优。在ICB模型中，研究人员在MC38、B16-F10等多种免疫原性不同的皮下肿瘤模型中，将DADA口服处理与抗PD-1抗体联合使用。结果显示，DADA能够显著增强抗PD-1单药的疗效，更有效地抑制肿瘤生长。这种协同增效同样伴随着肿瘤内CD8+T细胞数量的增加、Tpex细胞的富集以及效应细胞因子产生水平的提升。这表明，DADA通过扩充和维持对免疫治疗有响应的Tpex细胞库，从而增强了PD-1阻断的治疗效果。
DADA增强人CAR-T细胞的抗肿瘤效力
最后，研究将视角转向临床应用前景广阔的CAR-T细胞疗法。研究人员在体外制备靶向CD19的第二代CAR-T细胞，并在扩增过程中加入DADA处理。结果显示，DADA处理使CAR-T细胞中具有干细胞/中央记忆表型（CD62L+CCR7+）的群体比例增加，并促进了CAR-T细胞的体外扩增。当这些经过DADA“预处理”的CAR-T细胞经历多轮与CD19+Raji肿瘤细胞的共培养刺激（以诱导耗竭）时，它们表现出更低的耗竭标志物（PD-1, LAG-3, TIM-3, CD39）表达和更高的效应分子（IFN-γ, TNF-α, GZMB）表达。在Raji淋巴瘤荷瘤的免疫缺陷小鼠模型中，输注低于常规剂量的、经DADA处理过的CAR-T细胞，相比对照组细胞，能更有效地控制肿瘤进展，延长小鼠生存期。并且，在受体小鼠外周血中能检测到更多数量的、且耗竭标志物表达更低的CAR-T细胞，表明其体内持久性更好。重要的是，没有观察到DADA处理引起额外的组织损伤。这些发现强调了DADA作为一种简单、安全的“预处理”策略，在赋予CAR-T细胞更强干性、更好持久性和抗耗竭能力方面的巨大潜力，有望降低有效治疗所需的细胞剂量，从而降低CAR-T疗法的成本和制造时间。
讨论与展望
本研究系统阐述了DADA如何通过靶向PDK1，重塑CD8+T细胞代谢，增强其OXPHOS和线粒体功能，从而阻止终末耗竭、维持干细胞样特性，最终提升抗肿瘤免疫及多种免疫治疗策略的疗效。这一发现深化了我们对DADA抗肿瘤机制的理解：它不仅可以直接抑制肿瘤细胞糖酵解，还能“赋能”免疫系统，具有双重作用。研究特别指出，在不扰动糖酵解的前提下，专一性地增强OXPHOS就足以维持T细胞干性，这提示线粒体功能可能是比糖酵解转换更上游的调控枢纽。DADA对CAR-T细胞的增效作用，为降低这种昂贵疗法成本、提高可及性提供了新思路。该研究揭示了代谢干预在肿瘤免疫治疗中的重要作用，为将DADA这类安全性已知的“老药”应用于改善癌症免疫治疗奠定了坚实的临床前基础。
