新型m5C修饰的tRNA片段mtRC通过稳定RBM4抑制H3K18乳酸化，进而阻断膀胱癌恶性进展

《Advanced Science》：m5C-Modified tRF3b-CysGCA-23 Suppresses Bladder Cancer Malignancy by Repressing H3K18 Lactylation via Stabilizing RBM4

本研究揭示了一种新型NSUN6依赖的m5C修饰tRNA小片段（tRNA-derived small RNA, tsRNA）——m5C-tRF3b-CysGCA-23 (mtRC)，在膀胱癌（BC）中发挥关键抑癌作用。它通过直接结合并稳定RNA结合基序蛋白4 (RBM4)，抑制糖酵解，减少乳酸生成，从而降低组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化（H3K18la）水平，最终下调致癌基因IL1RAP和VASH2的表达。该研究首次阐明了tsRNA表观转录组修饰通过代谢-表观遗传轴调控膀胱癌恶性进程的新机制，为BC的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。

　　

1 引言

转运RNA衍生的小RNA（tsRNAs）是成熟或前体tRNA经位点特异性切割产生的，已成为重要的调控分子。tsRNAs继承自母本tRNA的大量化学修饰，这些修饰可能赋予其不同于未修饰版本的独特生物学活性。其中，胞嘧啶-5甲基化（m⁵C）是一种广泛存在的tRNA修饰。NOP2/Sun RNA甲基转移酶6（NSUN6）可特异性催化tRNA-Cys (GCA)等第72位胞嘧啶（C72）的m⁵C修饰。然而，m⁵C修饰的tsRNAs在膀胱癌（BC）中的生物学作用和调控机制尚不清楚。另一方面，组蛋白乳酸化是一种由细胞内乳酸驱动的新近发现的代谢-表观遗传修饰，与转录激活相关，在癌症进展中发挥作用，但其上游的表观转录组调控信号 largely unknown。

2 结果

2.1 鉴定膀胱癌细胞中下调的新型m⁵C修饰tsRNA——m⁵C-tRF3b-Cys^GCA-23

为探索m⁵C修饰tsRNAs在BC中的功能，研究团队在SV-HUC-1（正常尿路上皮细胞）、CdCl₂转化的恶性细胞（Cd-SV-HUC-1）和T24（BC细胞）中进行了m⁵C特异性甲基化小RNA免疫共沉淀（RIP）微阵列分析。通过比较分析，他们发现并聚焦于一个在恶性转化细胞中共同下调的m⁵C修饰tsRNA：m⁵C-tRF3b-Cys^GCA-23，将其命名为mtRC。进一步的tRNA亚硫酸氢盐测序确认了其修饰位点位于母本tRNA的C72。通过m⁵C免疫共沉淀-3’/5’接头连接RT-PCR和Northern blot实验证实，mtRC在Cd-SV-HUC-1和T24细胞中的表达水平显著低于SV-HUC-1细胞。在临床BC组织样本、CdCl₂诱导的多阶段大鼠膀胱癌模型组织，以及BC患者和模型大鼠的尿液标本中，mtRC的丰度均显著降低，并与致癌进展程度呈负相关，提示mtRC可能作为膀胱癌发生的生物标志物。5C-tRF3b-CysGCA-23 (mtRC) in transformed urothelial cells and bladder cancer (BC) cells.">

2.2 mtRC以修饰依赖的方式抑制膀胱癌细胞生长

功能实验表明，抑制mtRC可促进SV-HUC-1、Cd-SV-HUC-1和T24细胞的增殖。相反，过表达其未修饰的对应物tRF3b-Cys^GCA-23（tRC）对细胞增殖没有影响，而过表达mtRC则能显著抑制细胞增殖，这表明mtRC的生物学功能依赖于m⁵C修饰。在T24细胞裸鼠移植瘤模型中，瘤内注射mtRC的激动剂（agomir）能显著抑制肿瘤的生长和体积，而tRC的激动剂则无此效果，进一步在体内验证了mtRC修饰依赖性的肿瘤抑制作用。5C-tRF3b-Cys^GCA-23 suppresses BC growth.">

2.3 NSUN6调控mtRC的丰度

机制上，mtRC来源于tRNA-Cys (GCA)并携带位点特异性的m⁵C标记。研究证实，该修饰位点确实位于C72。已知NSUN6是催化该位点m⁵C修饰的甲基转移酶。在NSUN6敲低的Cd-SV-HUC-1细胞中，m⁵C特异性甲基化小RNA RIP微阵列分析显示，包括mtRC在内的四个来源于C72 m⁵C修饰母本tRNA的m⁵C-tsRNAs显著下调。点杂交和Northwestern blot实验显示，NSUN6敲低降低了整体m⁵C水平，而过表达则增加其水平。相应地，m⁵C IP-3’/5’接头连接RT-PCR实验证明，NSUN6敲低显著降低mtRC丰度，而过表达则增加mtRC水平。在J82细胞中也得到了类似结果。这些数据确立了NSUN6是mtRC丰度的上游决定因素。

2.4 NSUN6在膀胱癌中下调并抑制细胞增殖

对公共数据集和实验模型的分析显示，NSUN6在高级别、晚期BC组织中表达降低，在BC细胞系中表达也低于正常尿路上皮细胞。功能上，敲低NSUN6能增强Cd-SV-HUC-1和J82细胞的增殖能力，而过表达NSUN6则抑制T24细胞增殖。生存分析显示，NSUN6高表达的患者生存期更长。这些结果表明NSUN6在BC中发挥肿瘤抑制调节作用。

2.5 mtRC结合RBM4并增强RBM4蛋白稳定性

为探索mtRC抑制膀胱肿瘤发生的机制，研究合成了生物素标记的tRC、mtRC和阴性对照探针进行RNA pull-down实验。质谱分析及后续验证发现，只有RNA结合基序蛋白4（RBM4）特异性地与mtRC结合，RNA免疫共沉淀（RIP）实验进一步证实了该相互作用。通过构建GFP标记的RBM4截短体，RIP实验确定mtRC与RBM4的第II结构域结合。Western blot和免疫荧光实验表明，过表达mtRC能上调RBM4蛋白水平，而过表达tRC则无此效应。细胞核质分离实验显示mtRC主要分布在细胞质。环己酰亚胺（CHX）追踪实验证明mtRC延长了RBM4蛋白的半衰期。泛素化实验表明，mtRC通过抑制RBM4的泛素化/蛋白酶体依赖性降解来增强其稳定性。

2.6 RBM4在膀胱癌中低表达并抑制细胞增殖

在多阶段膀胱癌大鼠模型中，RBM4在CK5阳性尿路上皮细胞中的表达随着CdCl₂处理时间延长而逐渐降低。在Cd-SV-HUC-1和BC细胞系中，RBM4蛋白水平也低于SV-HUC-1细胞。功能上，敲低RBM4能增强Cd-SV-HUC-1和5637细胞的增殖，而过表达RBM4则抑制T24细胞增殖以及BC患者来源的类器官生长，支持其肿瘤抑制角色。回复实验表明，过表达RBM4可以挽救mtRC敲低引起的增殖增强，而敲低RBM4则可以部分逆转mtRC过表达对T24细胞增殖的抑制。在裸鼠移植瘤模型中，RBM4敲低也能部分逆转mtRC过表达对肿瘤生长的抑制作用，表明mtRC主要通过RBM4抑制BC细胞生长。

2.7 mtRC通过调控RBM4抑制膀胱癌细胞的糖酵解能力

对RBM4敲低的Cd-SV-HUC-1细胞进行RNA-seq分析，KEGG通路富集显示差异表达基因主要富集在糖酵解通路。细胞外酸化率（ECAR）实验证实，敲低RBM4增强了Cd-SV-HUC-1和5637细胞的糖酵解能力，而过表达mtRC则抑制了T24和5637细胞的糖酵解。重要的是，过表达RBM4可以挽救由mtRC敲低引起的糖酵解增强。RT-qPCR证实RBM4敲低上调了多个糖酵解相关基因的表达。进一步机制探索发现，RBM4并不通过调节糖酵解基因ALDOC的可变剪接来发挥作用。已知RBM4可通过靶向STAT1调节糖酵解，而STAT1是调控多个糖酵解基因表达的转录因子。本研究发现，RBM4敲低上调了STAT1的mRNA和蛋白水平。RIP实验表明RBM4与STAT1 mRNA结合，且RBM4敲低降低了这种结合，并增加了STAT1 mRNA的稳定性。在RBM4敲低的细胞中再次敲低STAT1，可降低多个糖酵解基因（ALDOA, ALDOC, BPGM, HK2, PDK1, ENO1）的表达。这些结果表明，RBM4至少部分是通过 destabilizing STAT1 mRNA，从而减弱STAT1依赖的糖酵解基因转录，来抑制糖酵解能力。

2.8 mtRC通过抑制H3K18乳酸化影响膀胱癌细胞增殖

由于mtRC抑制糖酵解，研究进一步探究了其对乳酸生成和组蛋白乳酸化的影响。mtRC过表达显著降低了T24细胞中的乳酸水平。用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）或草氨酸钠处理，或敲低乳酸脱氢酶A（LDHA）和B（LDHB），均能以剂量依赖的方式降低整体蛋白质乳酸化（pan-Kla）和组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）水平。值得注意的是，mtRC过表达也显著降低了整体乳酸化和H3K18la水平。添加外源性乳酸钠可以恢复LDHA/LDHB敲低或mtRC过表达细胞中的H3K18la水平。在BC细胞系中，整体乳酸化和H3K18la水平显著高于SV-HUC-1细胞。功能上，敲低LDHA/LDHB强烈抑制了Cd-SV-HUC-1和T24细胞的增殖，而乳酸钠处理可部分恢复这种被抑制的生长。同样，mtRC过表达对细胞增殖的抑制作用也可被乳酸钠处理部分挽救。这些数据表明，mtRC通过限制乳酸生产来降低组蛋白H3K18乳酸化，而H3K18la促进BC细胞增殖。

2.9 H3K18乳酸化增强膀胱癌中致癌基因IL1RAP和VASH2的转录

为鉴定mtRC下游受H3K18la调控的转录程序，研究对mtRC过表达的T24细胞进行了RNA-seq，并结合已发表的T24细胞H3K18la ChIP-seq数据、CUT&Tag结果、RBM4敲低后上调的基因等信息进行交集分析，最终将IL1RAP和VASH2确定为候选靶基因。在mtRC过表达细胞中，IL1RAP和VASH2的mRNA水平显著下调。染色质免疫共沉淀（ChIP）分析显示，H3K18la富集在IL1RAP和VASH2的启动子区域，且这种富集在mtRC过表达后减弱。蛋白水平上，糖酵解抑制剂或mtRC过表达均能降低IL1RAP和VASH2的蛋白表达，而乳酸钠补充则可上调其表达。公共数据集分析显示，IL1RAP在BC组织中上调且高表达与不良预后相关；VASH2高表达也与患者较差预后相关。在BC细胞系中，IL1RAP和VASH2蛋白表达上调。功能上，敲低IL1RAP或VASH2能显著抑制T24和5637细胞的体外增殖，并在裸鼠移植瘤模型中抑制肿瘤生长。这些发现确定IL1RAP和VASH2是H3K18乳酸化密切相关的致癌效应因子。

3 讨论

本研究首次揭示了NSUN6依赖的m⁵C修饰tsRNA——mtRC在BC中的关键抑癌作用。mtRC在BC组织和尿液中表达下调，与恶性进展负相关，具有作为生物标志物的潜力。NSUN6作为mtRC丰度的上游调控因子，本身在BC中也发挥肿瘤抑制作用。机制上，mtRC通过直接结合RBM4并阻断其泛素化降解来稳定RBM4蛋白。RBM4通过 destabilizing STAT1 mRNA来抑制STAT1的表达，进而下调其调控的多个糖酵解基因，最终抑制糖酵解和乳酸生成。降低的乳酸水平导致组蛋白H3K18乳酸化水平下降，从而减弱其对下游致癌基因IL1RAP和VASH2的转录激活，最终抑制BC的恶性进展。

4 实验方法

研究采用了多种实验技术，包括Arraystar Human m⁵C小RNA修饰微阵列、tRNA亚硫酸氢盐测序、m⁵C免疫共沉淀-3’/5’接头连接RT-PCR、Northern blot、Northwestern blot、RNA pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、蛋白质泛素化分析、染色质免疫共沉淀（ChIP）、细胞外酸化率（ECAR）检测、细胞增殖实验（CCK-8, EdU）、患者来源类器官培养以及裸鼠皮下移植瘤模型等。临床样本和动物实验均获得了相关伦理委员会的批准。

总结而言，该研究勾勒出一条mtRC/RBM4/糖酵解/H3K18la/IL1RAP&VASH2调控轴，将tsRNA的表观转录组修饰与代谢-表观遗传转录调控联系起来，为BC的发病机制提供了新的见解，并为诊断和治疗策略的开发提供了新的潜在靶点。5C-modified tsRNA, binds and stabilizes RBM4. RBM4 in turn destabilizes STAT1 mRNA, suppressing glycolysis and reducing lactate production. Decreased lactate leads to lower H3K18 lactylation, which dampens the transcription of oncogenic targets IL1RAP and VASH2, ultimately restraining bladder cancer progression.">