通过多巴胺生物粘附技术制备一种含有促进骨愈合细胞因子和细菌纤维素（BC）的小肠黏膜下层（SIS）复合骨支架，并对其生物性能进行评估

《Materials Chemistry and Physics》：Fabrication and biological properties evaluation of a small intestine submucosa (SIS) with intrinsic promoting bone healing cytokines/bacterial cellulose (BC) composite bone scaffold by polydopamine bioadhesion

本研究通过多巴胺生物吸附技术制备SIS/BC复合骨 scaffold，有效改善细菌纤维素微孔结构，提升水分保持能力（湿态下机械性能提升）及抗菌活性，同时利用SIS中内源性生长因子（TGF-β、VEGF）促进细胞粘附增殖，为骨损伤修复提供新策略。

　　

边铁荣|易博兴|罗洪丽|邢红云

中国泸州西南医科大学附属医院医学实验中心，646000

摘要

细胞因子调节多种细胞行为，包括增殖、迁移和分化，在促进新骨形成中起着关键作用。然而，将外源性细胞因子掺入骨支架中可能导致毒性、遗传毒性和致突变性。本研究的目的是开发一种含有内源性细胞因子的骨支架，以促进术后骨骼愈合并防止感染。使用多巴胺（PDA）的生物粘附作用，将猪小肠黏膜下层（SIS）/细菌纤维素（BC）复合骨支架制备出来，使BC粉末粘附在SIS膜上。通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对支架进行了表征，并通过吸水与保水能力、矿化作用和机械性能评估方法对其性能进行了评价。研究结果表明，SIS/BC复合支架具有三维纳米纤维网络和多层次微米级孔结构。这种处理破坏了BC的受限微孔（阻碍了细胞渗透/代谢），并将复合支架的吸水能力提高了三倍，同时改善了其在湿润状态下的机械性能。PDA以及SIS中固有的抗菌肽赋予了复合支架抗菌活性。特别是，猪小肠黏膜下层中的细胞因子（如转化生长因子-β（TGF-β）和血管内皮生长因子（VEGF）与PDA共同作用，促进了种子细胞的粘附和增殖。本文确定了复合支架促进细胞粘附和增殖的五条途径，以及其四种抗菌机制。PDA生物粘附的SIS/BC复合支架为修复骨损伤提供了一种有前景的策略。

引言

全球约有17.1亿人需要治疗大型骨缺损，这是导致残疾的主要原因^[1]。传统的骨移植方法存在固有的局限性，影响了治疗效果并限制了临床应用。然而，组织工程技术的最新进展提供了新的治疗选择。这些选择使用天然材料，这些材料具有生物相容性、良好的功能化学性质、可生物降解性和成本效益，并且可以大规模生产。这些材料在应对这一临床挑战方面具有巨大潜力^{2, 3}。

细菌纤维素（BC）具有类似于骨细胞外基质（ECM）的三维（3D）网络结构，具有良好的生物相容性和血液相容性。它在湿润条件下也具有优异的机械强度、低免疫原性以及高的吸水与保水能力，这些特性对于促进细胞生长至关重要^[4]。值得注意的是，与大多数在湿润状态下机械强度下降的材料不同，BC在湿润条件下表现出卓越的机械性能^[5]。此外，BC可以用作仿生形成天然骨磷灰石的生物模板，后者具有天然的骨传导性和骨整合性^[6]。支架材料的骨传导性为血管生长和新骨组织的形成提供了框架。骨整合对于确保支架与骨组织之间没有纤维结缔组织的形成至关重要，从而防止支架在植入后松动和失效^[7]。然而，BC纳米纤维膜网络的小孔尺寸（0.02-5 μm）限制了细胞渗透和代谢^[8]，并且BC缺乏抗菌性能，影响了其对感染的抵抗力，危及术后伤口愈合^[9]。

猪小肠黏膜下层（SIS）膜主要由有序排列的I型胶原纤维组成，这种骨胶原有助于矿化并形成高强度结构^{10, 11}，其三维纳米网络结构类似于骨ECM^[12]。SIS含有抗菌肽，已被证明能有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长，从而降低细菌污染的风险^[13]。除了抗菌活性外，SIS在人体内也是可生物降解的，其各种成分赋予了不同的生物活性。这些成分包括黏多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、肝素、纤维连接蛋白以及多种功能性生长因子（如bFGF、EGF、TGF-β和VEGF），它们促进细胞粘附、增殖和分化，从而避免了外源性细胞因子的毒性风险^{14, 15, 16, 17, 18, 19}。由于SIS的孔径分布为20至30 μm，其膜结构有效改善了材料内部的氧气和营养物质运输条件，从而缓解了局部缺氧和营养限制。研究表明，氧气供应不足会显著限制细胞存活并诱导代谢抑制，而稳定的材料运输环境有助于维持细胞功能并促进增殖^[20]。动物和临床研究均表明，完全无细胞的SIS不具有免疫原性，支持细胞生长、血管生成和组织再生^[11]。此外，像BC一样，SIS在模拟体液（SBF）中可以快速刺激透明质酸（HA）的合成^[19]，增强了其骨再生潜力。然而，SIS在湿润环境中的机械稳定性较差，降解会进一步降低其强度，这对承重骨支架来说是一个关键缺陷。

多巴胺（3,4-二羟基苯乙胺）具有类似贻贝蛋白的粘附特性，在碱性pH值下会发生自聚反应，在各种基底上通过儿茶酚和氨基之间的相互作用形成强粘附膜^[21]。PDA具有出色的成膜性能，并且生物相容性好，不会影响细胞生长和分化。相反，PDA的抗菌和促进细胞生长的特性使其成为骨支架的理想材料^{22, 23}。在本研究中，将BC粉末生物粘附在多巴胺涂层的SIS膜上，以破坏BC的受限微孔（0.02-5 μm），并解决其各自的局限性：BC的抗菌活性差和SIS在湿润环境中的机械性能不稳定问题。我们评估了支架在湿润状态下的吸水与保水性能以及机械性能。含有内源性生长因子的SIS避免了与外源性细胞因子相关的风险。BC和SIS（两者都是HA合成的模板）的结合有望协同增强骨支架的骨诱导性和骨整合潜力，支持其在骨替代材料中的应用。

部分内容

BC的制备

从上海 Hewu Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）购买了Burkholderia xylosoxidans ATCC 53582菌株，在Hestrin-Schramm（HS）培养基中以8-10%的接种浓度（28 °C，8天）进行静态发酵培养，以获得BC纳米纤维素膜。将BC纳米纤维膜用0.1-0.5 mol/L的NaOH溶液在65-80 °C下处理1-2小时，以破坏细胞膜，获得半透明、乳白色的BC膜。然后清洗这些膜

生物矿化前后复合支架的3D微观结构、成分和形态

图1显示了生物矿化前后SIS/BC纳米纤维复合骨支架的3D微观结构、成分和形态。图1A显示了SIS/BC复合支架的SEM形态和孔径分布，该支架具有三维纳米纤维网络和多层次微米级孔结构。与BC和SIS/BC支架（图1A）相比，后者的孔径范围为0.5至2.5 μm，而复合骨支架的孔径明显更大（P < 0.05）。

结论

我们报告了一种环保、简单且无需特殊设备的SIS/BC支架制备工艺。这种支架有效改善了BC纤维膜的微孔结构——这一问题此前阻碍了细胞渗透和代谢。模仿天然细胞外基质的3D纳米纤维网络，它具有优异的吸水与保水能力（比纯SIS支架高三倍），同时保持了良好的机械性能

作者贡献声明

易博兴：可视化、软件处理、数据分析。边铁荣：撰写初稿、资金获取、概念构思。邢红云：撰写与编辑、验证、项目管理、数据管理、概念构思。罗洪丽：软件处理、方法设计、数据分析

数据可用性

本研究中使用和分析的数据集可应相应作者的要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了以下资金的支持：（1）四川省科技计划（2022YFS0622）；（2）泸州市科技项目（2023SYF131）；（3）西南医科大学附属医院的博士研究启动基金；（4）大学生创新创业培训计划（202310632051）