《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Hyperglutaminolysis drives senescence and aging through arginine-mTORC1 axis activation
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本刊推荐一项揭示衰老新机制的重要研究。针对衰老过程中谷氨酰胺（Gln）代谢失调机制不明的问题，研究人员系统探讨了“高活性谷氨酰胺分解”（hyperglutaminolysis）在细胞衰老与个体衰老中的作用。研究发现，在衰老细胞与老龄动物中，谷氨酰胺分解关键酶GLS1活性上调，其催化产生的谷氨酸（Glu）和铵离子（NH4+）可驱动精氨酸（Arg）从头合成，进而通过CASTOR1感知激活mTORC1信号轴，最终促发衰老表型。这项研究不仅揭示了调控衰老的一条全新代谢信号通路，也为干预衰老及相关疾病提供了新的潜在靶点。
随着全球人口老龄化加剧，理解衰老的本质并寻找延缓衰老的策略已成为生命科学领域的核心挑战之一。衰老被定义为生物体生理完整性和功能的进行性丧失，是老年相关疾病的主要风险因素。近年研究表明，细胞衰老是机体衰老的一个明确标志，衰老细胞的积累在衰老进程中扮演着关键角色。有趣的是，衰老的进程与细胞代谢紊乱，特别是葡萄糖和脂质代谢的失调密切相关。然而，与葡萄糖和脂质代谢相比，我们对衰老细胞中氨基酸代谢状态及其影响的了解要少得多，尤其是关于谷氨酰胺代谢在衰老和细胞衰老中的作用和影响，更是知之甚少。
谷氨酰胺是人体内最丰富的游离氨基酸，是许多生物体主要的碳源和氮源。它的分解代谢对于维持生命至关重要，其第一步由谷氨酰胺酶1（GLS1）催化，通常被称为谷氨酰胺分解。这一过程将谷氨酰胺转化为谷氨酸和铵离子，产物随后进入支链代谢反应网络。谷氨酰胺分解常被赋予抗氧化和抗衰老的潜力，这主要基于补充谷氨酰胺在提高体内谷胱甘肽（GSH）水平和缓解氧化应激方面的有益作用。然而，支持谷氨酰胺分解具有抗衰老潜力的证据并不足够坚实。例如，反复的研究表明，在老年个体或患有衰老相关疾病的个体的衰老细胞和组织中，谷氨酰胺水平并未降低。此外，在老年背景下的人类和小鼠组织中，观察到了谷氨酰胺分解增强及其下游代谢物（如谷氨酸、铵离子和α-酮戊二酸）水平升高。这些发现强烈表明，有必要从谷胱甘肽合成和三羧酸循环之外的视角，全面探索谷氨酰胺分解在衰老过程中的影响。
为了厘清谷氨酰胺分解与衰老之间错综复杂的关系，并探究其背后的分子机制，一组研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表了一项深入研究。他们依次考察了衰老特异性状态下谷氨酰胺分解代谢的状态、谷氨酰胺及其分解在衰老进程中的作用，以及它们对精氨酸生物合成-mTORC1通路的影响。
研究人员综合运用了多种关键技术方法来验证其假设。在细胞水平，他们建立了过氧化氢（H22O2）和阿霉素（ADR）诱导的应激性早衰模型，以及人成纤维细胞（hFB）的复制性衰老模型。在动物水平，他们利用了自然衰老的果蝇和小鼠，以及过氧化氢应激诱导的加速衰老果蝇模型。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台对细胞和水溶性代谢物进行了非靶向和靶向代谢组学分析。为了探究功能，他们采用了多种干预手段限制谷氨酰胺分解，包括低谷氨酰胺培养基培养、使用谷氨酰胺酶抑制剂（DON和CB-839）以及小干扰RNA（siRNA）敲低GLS1基因。在果蝇中，他们构建了GLS基因的RNA干扰（RNAi）敲低品系，并进行了寿命、攀爬能力、肠道通透性（Smurf表型）等分析。在小鼠中，他们使用了腺相关病毒9型（AAV9）介导的argi-nosuccinate lyase（ASL）基因敲低。此外，研究还运用了多种分子生物学技术，包括SA-β-gal衰老染色、蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测蛋白表达与磷酸化、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测基因表达、免疫荧光检测蛋白共定位、流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡，以及基于RFP-GFP-LC3串联蛋白的自噬流检测。
研究结果
1. 衰老细胞中谷氨酰胺代谢的改变
通过代谢组学分析，研究人员发现在过氧化氢诱导的衰老细胞中，147种检测到的代谢物里有88种上调，7种下调。值得注意的是，大多数α-氨基酸被上调。KEGG通路富集分析进一步强调了α-氨基酸代谢的重要性，排名前30的富集通路中有19条与氨基酸相关。在由这19条α-氨基酸相关通路中的74种代谢物构建的网络中，谷氨酰胺是中心性最高的代谢物，揭示了衰老细胞中氨基酸代谢，特别是谷氨酰胺代谢发生了显著改变。
2. 高活性谷氨酰胺分解发生于衰老细胞和衰老动物
研究证实，在三种不同的衰老细胞模型中，谷氨酰胺的消耗率均高于其增殖对应细胞。同时，谷氨酰胺酶1（GLS1）蛋白水平和总体GLS活性在衰老细胞中均上调。谷氨酰胺分解的直接产物谷氨酸和铵离子在衰老细胞中也显著升高。这些发现证明了衰老细胞中谷氨酰胺分解上调，研究人员将这种代谢状态定义为“高活性谷氨酰胺分解”。在自然衰老的果蝇、过氧化氢应激的果蝇以及27月龄老年小鼠的肾脏、脾脏和肌肉组织中，GLS活性也显著高于年轻对照组。这些结果共同表明，高活性谷氨酰胺分解是从小鼠和人类衰老成纤维细胞到衰老果蝇和小鼠等多种衰老模型中保守的代谢状态。
3. 限制谷氨酰胺分解可缓解细胞衰老和果蝇衰老
通过低谷氨酰胺培养基培养、使用GLS抑制剂（DON、CB-839）或敲低Gls1基因来限制谷氨酰胺分解，均能显著降低衰老细胞中SA-β-gal阳性细胞的比例和p16蛋白的表达，并抑制衰老相关分泌表型（SASP）因子的表达。在果蝇中，敲低Gls基因（GLS-KD）可显著延长其中位寿命和最大寿命，提高攀爬能力，减少Smurf表型，并降低炎症因子egr（果蝇中Tnf的同源基因）的表达。同样，在过氧化氢应激的果蝇中使用GLS抑制剂处理，也能改善其存活率和健康span指标。这些体内外实验结果表明，限制谷氨酰胺分解对衰老和老化进程具有抑制作用。进一步研究发现，这种缓解作用主要依赖于其对衰老诱导过程的阻断，而非促衰老细胞凋亡的“溶衰”效应。
4. 高活性谷氨酰胺分解导致衰老细胞中mTORC1异常激活
mTORC1在衰老细胞中被已知为异常激活。研究发现，GLS抑制剂DON和siGls1能显著降低衰老细胞中p70/S6K和4EBP1的磷酸化水平，并减少mTOR与溶酶体膜蛋白LAMP2的共定位，表明mTORC1活性降低。同时，这些处理增强了自噬流（表现为红色LC3斑点增加和p62积累减少）。相反，高浓度谷氨酰胺补充能特异性诱导衰老细胞（而非增殖细胞）中p70/S6K磷酸化显著增加。这些结果证明，衰老细胞中的高活性谷氨酰胺分解显著促进了mTORC1的异常激活，而抑制谷氨酰胺分解则可降低mTORC1活性并增强下游自噬流。
5. 高活性谷氨酰胺分解导致精氨酸生物合成增强
为了解高活性谷氨酰胺分解连接mTORC1激活的分子级联，研究人员进行了新一轮代谢组学分析，重点关注与谷氨酰胺分解-精氨酸生物合成轴相关的代谢物。他们发现，在衰老细胞中上调、且可被GLS抑制剂CB-839下调的代谢物中，包含精氨酸及其两个前体物质——天冬氨酸和瓜氨酸。定量分析显示，衰老细胞中精氨酸水平升高，并可被CB-839处理降低。同样，在自然衰老和氧化应激的果蝇体内，精氨酸及其生物合成前体的水平也升高，而DON处理或敲低Gls基因可降低其水平。这些结果强调了高活性谷氨酰胺分解与精氨酸生物合成上调之间的内在联系。
6. 谷氨酰胺分解-精氨酸轴促进mTORC1激活
功能实验证实，在谷氨酰胺分解被DON抑制的条件下，补充谷氨酸加氯化铵、天冬氨酸加瓜氨酸、或直接补充精氨酸，均可增强mTORC1的激活。相反，敲低精氨酸生物合成通路中的关键酶（GOT2、OTC、ASS1、ASL）则会抑制mTORC1活性。在老年小鼠的肾脏、脾脏和肌肉组织中，精氨酸水平更高，p70/S6K磷酸化水平也更高。通过AAV9介导在小鼠骨骼肌中敲低Asl基因，可有效降低组织内的精氨酸水平和p70/S6K磷酸化。这些体内外结果强调了谷氨酰胺分解驱动的精氨酸生物合成在mTORC1激活中的关键作用。
7. 上调的谷氨酰胺分解-精氨酸轴促进衰老进程
长期用高浓度的谷氨酰胺、谷氨酸加铵离子、天冬氨酸加瓜氨酸或精氨酸处理增殖细胞，可增加细胞的SA-β-gal染色和SASP表达，表明其促进了衰老。相反，敲低Asl基因可减少过氧化氢应激细胞中的衰老标记。在果蝇中，食物补充谷氨酰胺或精氨酸会缩短其寿命。这些发现证明，高活性谷氨酰胺分解提升的精氨酸生物合成对衰老进程至关重要。
8. 谷氨酰胺分解诱导的mTORC1激活由精氨酸传感器CASTOR1介导
CASTOR1是已知的精氨酸传感器蛋白。研究发现，敲低CASTOR1可减弱DON和siGls1对mTORC1活性的抑制作用，并阻断其改善自噬流和缓解衰老的能力。反之，过表达CASTOR1则能抑制谷氨酰胺补充诱导的p70/S6K磷酸化。这些结果表明，谷氨酰胺分解诱导的mTORC1激活是由精氨酸-CASTOR1级联介导的。
研究结论与意义
本研究识别了衰老细胞一个新的代谢特征——高活性谷氨酰胺分解，并验证了其对衰老发展的促进作用。研究进一步揭示，这种上调的谷氨酰胺分解代谢伴随着精氨酸生物合成的增强、mTORC1的异常激活和自噬抑制。通过机制分析，研究人员证明这些事件通过一个特殊的分子级联相联系：该级联从GLS活性升高开始，导致铵离子和谷氨酸生成增加，进而增强精氨酸生物合成；精氨酸随后被CASTOR1感知，导致mTORC1激活和自噬受损，最终驱动衰老/老化发展。
这项工作的意义在于，它从全新的角度阐释了失调的谷氨酰胺分解在衰老加速中的独特作用和机制，并建立了一条与谷氨酰胺分解-精氨酸生物合成-mTORC1轴相关的新信号通路。传统上，谷氨酰胺分解因支持谷胱甘肽合成和三羧酸循环而被认为具有抗氧化和抗衰老潜力。然而，本研究聚焦于其下游另一条通路——精氨酸生物合成，并将其与衰老的核心调控枢纽mTORC1的异常激活直接联系起来，极大地扩展了我们对谷氨酰胺分解代谢影响的理解。此外，该研究为衰老细胞中持续性（异常）mTORC1激活的代谢根源提供了新的解释，即高活性谷氨酰胺分解作为一个持续的代谢驱动刺激，通过提升精氨酸生物合成和持续抑制CASTOR1，导致了生长因子非依赖性的、持续的mTORC1激活。这些发现不仅丰富了我们对衰老进程的认识，也为旨在缓解衰老相关过程、识别新的干预靶点提供了有价值的见解。尽管谷氨酰胺的生物学必要性已知，但如何精确控制和利用谷氨酰胺分解以改善健康，仍需进一步研究。
