外源性EB病毒核抗原1通过驱动ADAR1介导的RNA编辑诱导肿瘤对免疫疗法的抵抗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Exogenous Epstein–Barr virus nuclear antigen 1 induces ADAR1-driven tumor resistance against immunotherapy

免疫检查点阻断疗法面临因干扰素信号抑制而导致的肿瘤耐药性限制，EBV-encoded EBNA1是其中一种未被充分阐明的病毒因素。本研究揭示了外源性EBNA1通过增强RNA编辑酶ADAR1介导的RNA编辑驱动免疫抑制。研究人员发现EBNA1可与IGF2BP3、EIF4G1形成三聚体复合物，增强ADAR1翻译，其编辑活性进而增加dsRNA的A-to-I编辑，掩盖免疫刺激信号，削弱干扰素通路。重要的是，靶向EBNA1的PROTAC降解剂EP-1215与抗PD-1联用，可恢复干扰素信号，增强T细胞浸润，在人类化小鼠中抑制EBNA1阳性肿瘤。该研究提示靶向EBNA1是将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤、克服免疫治疗耐药的一种潜在策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade, ICB）疗法，例如针对PD-1/PD-L1的抗体药物，已革新了多种恶性肿瘤的治疗格局，展现出令人瞩目的临床疗效。然而，一个严峻的现实是，仅有约20-30%的癌症患者能从ICB疗法中获得持久的临床获益，大部分患者的肿瘤存在原发性或获得性耐药。深入理解并克服这种耐药性，成为当前肿瘤免疫学研究的核心挑战之一。一个关键的耐药特征是所谓的“冷”肿瘤，这类肿瘤表现出低水平的免疫细胞（尤其是CD8⁺T细胞）浸润，对免疫疗法反应不佳。因此，寻找能将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的有效策略至关重要。

与此同时，病毒与肿瘤免疫之间的关系日益受到关注。EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV）是一种普遍存在的致癌疱疹病毒，与包括鼻咽癌、胃癌和多种淋巴瘤在内的多种人类恶性肿瘤存在病因学联系。在EBV编码的潜伏期蛋白中，EB病毒核抗原1（Epstein–Barr virus nuclear antigen 1, EBNA1）是唯一在所有EBV阳性的鼻咽癌细胞中持续表达的蛋白，它在病毒潜伏感染和宿主细胞存活中扮演着关键角色。尽管有研究表明EBNA1可能通过招募调节性T细胞等方式促进免疫逃逸，但其调控肿瘤免疫微环境，特别是与免疫治疗耐药相关的具体分子机制仍不清楚。

在另一条研究前沿线上，RNA编辑，特别是由腺苷脱氨酶作用于RNA 1（Adenosine deaminase acting on RNA 1, ADAR1）催化的腺苷到肌苷（A-to-I）编辑，被发现是肿瘤免疫中的一个重要调控层。ADAR1可以编辑双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA），防止其被MDA5、PKR等模式识别受体识别，从而避免异常激活I型干扰素（Type I interferon, IFN）信号通路。多项研究证实，ADAR1的缺失能敏化肿瘤对抗免疫介导的杀伤，并增强其对免疫检查点阻断的反应。那么，是否有一种机制能将外源性病毒因子、宿主RNA编辑与肿瘤免疫抑制联系起来呢？近期发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上的一项研究，为我们揭示了EBNA1如何“劫持”宿主的ADAR1通路，驱动肿瘤形成免疫抑制微环境，从而抵抗免疫治疗，并提出了一个创新的应对策略。

研究人员为阐明EBNA1、ADAR1与免疫治疗耐药之间的关系，综合运用了多种前沿技术。在细胞和分子机制层面，他们采用了免疫共沉淀联合质谱分析鉴定EBNA1的相互作用蛋白，并通过RNA免疫沉淀测序、MeRIP测序（m⁶A-seq）和全转录组测序分析了RNA结合、甲基化修饰和编辑事件。体内外功能验证则通过构建EBNA1过表达或敲低的细胞模型，利用单细胞RNA测序分析肿瘤免疫微环境组成，并通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体谱分析评估翻译效率。在临床相关性方面，研究分析了来自GEO和TCGA的公共数据集，并对来自深圳医科大学南方医院（SMU）的40例鼻咽癌患者和45例慢性鼻炎正常对照的组织芯片样本进行了免疫组化和生存分析。在治疗策略开发上，他们基于结构设计并合成了靶向EBNA1的蛋白水解靶向嵌合体降解剂，并利用免疫缺陷NCG小鼠、C57BL/6小鼠以及人源化CD34⁺造血干细胞重建的小鼠模型，评估了单独或联合抗PD-1抗体的治疗效果。体外共培养实验则利用Sartorius Incucyte? SX5活细胞分析系统评估了T细胞对肿瘤的杀伤效应。

外源性EBNA1诱导肿瘤免疫抑制微环境

研究人员首先在鼻咽癌细胞系HK1和黑色素瘤细胞系B16中过表达EBNA1，并将其分别植入免疫缺陷NCG小鼠和免疫健全的C57BL/6小鼠。结果显示，EBNA1本身并不直接促进肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的增殖，但在免疫健全小鼠体内，EBNA1过表达的B16肿瘤生长显著更快，这表明EBNA1促瘤效应是免疫依赖性的。通过单细胞RNA测序分析肿瘤浸润的CD45⁺免疫细胞，研究人员发现EBNA1过表达的肿瘤呈现出显著的免疫抑制特征：CD8⁺T细胞、自然杀伤细胞等免疫激活细胞浸润减少，而具有免疫抑制功能的M2型巨噬细胞数量增加。这些CD8⁺T细胞表现出衰竭表型，而巨噬细胞则向M2型极化。基因集富集分析进一步显示，在EBNA1过表达的肿瘤中，干扰素γ和干扰素α反应通路在所有免疫细胞类型中均被广泛削弱，肿瘤微环境中的IFNβ和IFNγ蛋白水平也显著降低。对临床样本的分析也证实，EBNA1持续阳性的鼻咽癌组织中CD8⁺T细胞浸润显著少于EBNA1阴性的正常鼻咽上皮组织。这些结果综合表明，外源性EBNA1能够建立一个深度的免疫抑制性肿瘤微环境。

EBNA1通过与m⁶A阅读器IGF2BP3相互作用靶向ADAR1

为了探究EBNA1诱导免疫抑制的分子机制，研究人员通过免疫共沉淀-质谱联用技术筛选出250个EBNA1潜在相互作用蛋白，其中包含11个与m⁶A修饰相关的因子。在m⁶A阅读器蛋白中，IGF2BP3在鼻咽癌组织中高表达，并与EBNA1存在相互作用。进一步的机制研究表明，EBNA1与IGF2BP3的KH3-KH4结构域结合，而该结构域中的GxxG基序对于IGF2BP3识别m⁶A修饰至关重要。通过生物信息学交叉分析EBNA1靶基因和IGF2BP3靶基因的免疫与病毒感染相关通路，研究人员锁定了关键靶点ADAR1。临床样本的免疫组化分析显示，在鼻咽癌组织中，EBNA1、IGF2BP3和ADAR1的表达水平均显著上调，且三者表达呈正相关。高ADAR1表达与鼻咽癌患者更差的总生存期和无进展生存期相关，在公共数据集中，ADAR1表达也与CD8⁺T细胞浸润呈负相关，提示其与免疫抑制相关。

外源性EBNA1通过IGF2BP3依赖性m⁶A修饰及招募EIF4G1增强ADAR1翻译

研究进一步阐明了EBNA1调控ADAR1的具体方式。MeRIP-qPCR和RIP-qPCR实验证实，EBNA1促进了ADAR1 mRNA的m⁶A修饰，并增强了IGF2BP3对ADAR1 mRNA的结合。然而，EBNA1的过表达并未改变ADAR1 mRNA的稳定性，提示其调控可能发生在翻译水平。通过免疫共沉淀和RNA pull-down联合质谱分析，研究人员发现真核翻译起始因子4G1（eukaryotic translation initiation factor 4G1, EIF4G1）是同时与EBNA1、IGF2BP3和ADAR1 mRNA相互作用的顶级候选蛋白。实验证实，EBNA1、IGF2BP3和EIF4G1在细胞中形成复合物。多聚核糖体谱分析显示，EBNA1过表达增加了ADAR1 mRNA与多聚核糖体的结合，表明其翻译效率增强。敲低EIF4G1则几乎完全消除了ADAR1的蛋白表达。这些证据表明，EBNA1通过与IGF2BP3和EIF4G1形成复合物，特异性地增强了ADAR1的翻译，而非影响其RNA稳定性。

EBNA1介导的ADAR1减少干扰素释放并与肿瘤免疫治疗反应性降低相关

功能实验表明，EBNA1的存在削弱了T细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤作用，也降低了干扰素刺激下肿瘤细胞自身的反应性。在机制上，EBNA1通过上调ADAR1，增强了其对dsRNA的A-to-I编辑活性，特别是在靠近干扰素相关基因的短散在核元件内。这种编辑“掩盖”了内源性dsRNA的免疫刺激信号，导致下游RNA传感器（如MDA5、PKR、RIG-I）的激活被削弱，干扰素通路失活，干扰素释放减少。全转录组测序和Sanger测序验证了在IFNβ刺激下，EBNA1表达的细胞中SINE区域的A-to-I编辑事件显著增加。在EBV阳性的C666-1细胞中进行的拯救实验进一步证明，敲低EBNA1可增强T细胞杀伤和RNA传感器表达，而重新导入ADAR1则逆转了这一效应。这表明EBNA1-ADAR1轴是肿瘤抵抗免疫治疗的关键介质。

靶向EBNA1的PROTAC降解剂增强CD34⁺人源化小鼠中ICB疗法的疗效

基于上述机制，研究人员设计并合成了首个靶向EBNA1的蛋白水解靶向嵌合体降解剂，其中EP-1215在体外能有效降解EBNA1并降低ADAR1蛋白水平。在C57BL/6小鼠模型中，EP-1215与抗PD-1抗体的联合应用对EBNA1过表达的肿瘤产生了显著的协同抗肿瘤效果，并增加了肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润和IFNγ的产生。更重要的是，在更贴近人体免疫环境的CD34⁺造血干细胞重建的人源化小鼠模型中，EP-1215单药或与抗PD-1联合，均能有效抑制EBNA1过表达或EBV阳性的鼻咽癌肿瘤生长，且联合疗法效果最佳。初步的安全性评估未观察到EP-1215引起明显的肝毒性或肾毒性。

研究结论与讨论

本研究的核心结论是，外源性EB病毒蛋白EBNA1能够通过与宿主m⁶A阅读器IGF2BP3和翻译起始因子EIF4G1形成三聚体复合物，特异性地增强免疫调节酶ADAR1的翻译。上调的ADAR1蛋白进而增加对dsRNA（特别是干扰素基因附近的SINE元件）的A-to-I编辑，从而“伪装”内源性免疫刺激信号，抑制RNA传感器的激活和I型干扰素通路的响应。这一系列事件最终导致肿瘤微环境向免疫抑制状态转变，CD8⁺T细胞浸润减少、功能耗竭，使得肿瘤对免疫检查点阻断疗法产生抵抗。研究人员将这一新发现的调控轴定义为“EBNA1–IGF2BP3–EIF4G1–ADAR1轴”。

这项研究的意义重大。首先，它首次揭示了ADAR1可以作为外源性病毒蛋白的一个未知宿主靶点，将病毒免疫逃逸与宿主RNA编辑机制直接联系起来，为理解病毒相关肿瘤的免疫抑制提供了全新视角。其次，研究阐明了EIF4G1在启动ADAR1翻译中的关键作用，揭示了ADAR1表达调控的一个前所未知的翻译层面。再者，研究证实了病毒通过ADAR1编辑的dsRNA来抑制免疫的完整通路，为“结构性解除武装”模型提供了支持。最后，也是最具转化潜力的成果是，研究人员成功开发了首个靶向EBNA1的PROTAC降解剂EP-1215。临床前研究证明，EP-1215能够有效降解EBNA1，逆转其介导的免疫抑制，并与抗PD-1疗法产生强大的协同效应，在人类化小鼠模型中显著抑制肿瘤生长。这种策略具有精准靶向病毒蛋白、间接调节ADAR1而不伤及正常组织的潜在安全性优势，为克服EBV相关恶性肿瘤的免疫治疗耐药性开辟了一条崭新的治疗途径。未来，将降解剂与新型递送技术（如基于外泌体的鼻喷雾剂）结合，并与现有免疫疗法联用，有望为鼻咽癌等患者带来新的希望。当然，研究也存在一些局限，例如对高度重复的SINE区域RNA编辑位点的全面验证存在技术挑战，以及对EBNA1-IGF2BP3相互作用界面的精细结构功能分析有待深入。这些都将成为未来研究的方向。总体而言，这项研究不仅深化了对EBV驱动免疫抑制机制的理解，更为临床治疗EBV阳性恶性肿瘤提供了具有前景的候选策略。