胆固醇驱动SARS-CoV-2刺突蛋白寡聚化的分子机制及其在膜融合与病毒入侵中的关键作用

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Molecular mechanism of cholesterol-dependent membrane fusion in SARS-CoV-2 entry

本文针对SARS-CoV-2入侵过程中胆固醇调控膜融合的具体机制尚不明确这一科学问题，通过构建体外囊泡-囊泡融合体系、单囊泡成像、细胞-细胞融合及假病毒感染实验，系统揭示了胆固醇通过与其C端胞质区富含半胱氨酸结构域(CRR)的棕榈酰化修饰特异性互作，诱导刺突蛋白(Spike)形成寡聚簇，从而显著增强病毒膜与宿主细胞膜的锚定(docking)效率，进而促进后续膜融合与病毒入侵。该研究阐明了胆固醇在冠状病毒入侵中的精确调控角色，为靶向CRR-胆固醇相互作用开发广谱抗冠状病毒药物提供了新靶点。

　　

2019年末，一场由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的疫情席卷全球。这种病毒狡猾地利用其表面的“钥匙”——刺突蛋白(Spike)，去打开人体细胞表面的“锁”——血管紧张素转换酶2(ACE2)受体，从而实现入侵。入侵的终极一步，是病毒的外膜与宿主细胞的细胞膜发生融合，如同两个肥皂泡合二为一，将病毒的遗传物质释放进细胞。然而，这个融合过程并非孤立发生，它深受细胞膜这个复杂“舞台”的影响。细胞膜并非均一的脂质双分子层，其中分布着像胆固醇这样的关键分子。胆固醇不仅是维持膜结构稳定的“混凝土”，还能调控镶嵌在膜中蛋白质的构象与功能。此前的研究已广泛提示，胆固醇在包括SARS-CoV-2在内的多种包膜病毒入侵中扮演着重要角色，但其精确的调控机制，尤其是在病毒膜（而非宿主细胞膜）一侧的具体作用方式，仍然笼罩在迷雾之中。特别是，刺突蛋白那个伸向病毒内部的“尾巴”——C端胞质区，它经历了棕榈酰化修饰（一种将脂肪酸链共价连接到蛋白质半胱氨酸残基上的过程），被认为可能与脂筏（富含胆固醇和鞘脂的膜微区）相互作用，但这个区域如何在胆固醇感知和病毒入侵中发挥作用，几乎未被探索。为了拨开这层迷雾，研究人员开展了一项深入研究，其成果发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊。

为了揭示胆固醇在SARS-CoV-2入侵中的精确作用，研究人员综合运用了多种前沿的生物物理与细胞生物学技术。他们首先建立了一个高度可控的体外重建系统，将纯化的工程化刺突蛋白和ACE2蛋白分别重构到两组脂质体上，模拟病毒膜和宿主细胞膜，从而实现了对膜脂组成的精确调控。在此基础上，他们进行了囊泡-囊泡内容物混合的批量实验和单囊泡成像分析，后者包括单囊泡锚定、脂质混合及内容物混合 assay，能够分解并定量分析膜融合的不同子步骤（如docking和fusion pore opening）。在细胞水平，研究人员采用了细胞-细胞融合实验（通过共培养表达Spike和ACE2的细胞观察合胞体形成）和SARS-CoV-2假病毒感染实验（通过荧光素酶报告基因检测感染效率）来验证生理相关性。为了在纳米尺度观察Spike蛋白的空间分布及其与胆固醇的共定位，他们使用了结构光照明显微镜(SIM)超分辨成像技术。最后，为了在单分子水平解析Spike蛋白的寡聚状态，他们开发了基于位点特异性生物偶联和单分子光漂白分析的方法，对重构在支撑脂双层(SLB)或源自细胞膜的囊泡上的Spike蛋白进行定量计数。

研究结果

胆固醇促进重建体系中的刺突蛋白介导的膜融合

研究人员构建了Spike¹²⁶⁸（一种C端截短5个氨基酸以增强表达的工程化Spike）囊泡和ACE2囊泡体系。批量融合实验表明，当病毒膜（Spike囊泡）含有≥10 mol%的胆固醇时，Spike介导的囊泡-囊融合效率显著提升。而在宿主膜（ACE2囊泡）一侧增加胆固醇，对融合效率影响轻微，仅在极高浓度(50 mol%)时表现出抑制，这可能是胆固醇过载改变膜流动性所致。这表明胆固醇的促进作用主要源于病毒膜侧。

胆固醇特异性增强Spike¹²⁶⁸介导的囊泡锚定

为了区分胆固醇是影响了病毒与细胞的初始接触（锚定）还是后续的膜合并（融合），研究人员进行了单囊泡实验。单囊泡锚定实验显示，增加Spike囊泡中的胆固醇含量，能显著提高其与ACE2囊泡的锚定概率。然而，在单囊泡内容物混合（反映完整膜融合）实验中，胆固醇水平的变化并未改变融合孔打开的概率。这表明，胆固醇主要通过促进病毒膜与宿主细胞膜的初始锚定来提升整体融合效率，而对锚定后的融合动力学步骤影响甚微。

细胞膜上的胆固醇是Spike¹²⁶⁸介导的细胞融合所必需的

在细胞-细胞融合模型中，使用甲基-β-环糊精(MβCD)耗竭表达Spike的细胞膜上的胆固醇，可显著抑制合胞体形成；而用MβCD-胆固醇复合物(MβCD-CHO)补充胆固醇后，融合能力得以恢复。类似地，用MβCD预处理SARS-CoV-2假病毒以耗尽其膜胆固醇，会显著降低病毒感染力；补充胆固醇则能增强感染，并呈现出剂量依赖性的促进或抑制效应。这些结果在更接近生理的环境中印证了胆固醇对Spike介导膜融合的关键作用。

胆固醇诱导Spike¹²⁶⁸形成簇状结构

为了探究胆固醇促进锚定的机制，研究人员利用SIM超分辨成像观察了细胞膜上Spike蛋白的分布。他们发现，在胆固醇充足的细胞膜上，Spike蛋白倾向于形成密度更高、直径更大的簇状结构；而在胆固醇耗竭的膜上，Spike的分布则更为分散。这表明胆固醇能驱动Spike蛋白在膜上发生空间重排，形成纳米尺度的聚集。

胆固醇调控Spike¹²⁶⁸簇的寡聚状态

通过单分子光漂白技术，研究人员在单分子水平对Spike蛋白的寡聚状态进行了定量。他们将一个Q3肽标签基因插入到Spike¹²⁶⁸的N端（Spike^1268_Q3），并利用微生物转谷氨酰胺酶(gpTGase)进行位点特异性Cy5荧光标记。将该蛋白重构到含有或不含胆固醇的支撑脂双层(SLB)上，或使用经胆固醇调控的细胞膜制备的SLB进行分析。结果显示，在富含胆固醇的膜环境中，每个Spike蛋白簇中包含的Spike单体拷贝数显著多于胆固醇缺失的膜环境。这直接证明了胆固醇能诱导Spike蛋白形成更高阶的寡聚体。

Spike的C端胞质结构域对其胆固醇依赖的功能至关重要

研究人员构建了胞质区截短的Spike突变体（Spike¹²³⁴）。在单囊泡锚定实验中，Spike¹²³⁴囊泡失去了胆固醇对锚定的增强作用。SIM成像和Pearson相关性分析显示，与全长Spike¹²⁶⁸相比，Spike¹²³⁴与胆固醇的共定位显著减弱，且其簇状结构的形成不再受胆固醇水平的调控。在细胞-细胞融合实验中，Spike¹²³⁴介导的合胞体形成也对胆固醇调制不敏感。这些结果表明，Spike蛋白的C端胞质区是感知膜胆固醇并介导其依赖性功能的关键模块。

CRR的棕榈酰化修饰介导胆固醇依赖的Spike蛋白成簇和病毒锚定效率

Spike蛋白胞质区内含有一个富含10个半胱氨酸的保守区域(CRR)，是棕榈酰化的位点。研究人员将CRR中的所有半胱氨酸突变为丙氨酸，构建了突变体Spike^1268_10A。该突变体丧失了与胆固醇的直接结合能力。在功能上，Spike^1268_10A介导的囊泡融合、细胞融合均不再受胆固醇水平的调节。SIM成像显示其无法形成胆固醇依赖性的簇状结构，单囊泡锚定实验中也观察不到胆固醇的增强效应。此外，用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸(2-BP)处理假病毒，能剂量依赖性地抑制病毒感染。这些数据强有力地证明，CRR的棕榈酰化修饰是Spike蛋白与胆固醇相互作用、进而形成功能性寡聚簇所必需的。

结论与讨论

本研究通过多层次的实验体系，系统阐明了胆固醇在SARS-CoV-2入侵中的精确分子机制。核心结论是：位于病毒膜上的胆固醇，通过与Spike蛋白C端胞质区内棕榈酰化的CRR特异性相互作用，诱导Spike蛋白发生横向重组，形成高阶寡聚簇。这种空间纳米级的重组装，犹如在病毒表面组建了一个个“登陆平台”，通过多价的ACE2受体结合，极大地增强了病毒膜与宿主细胞膜的初始锚定效率，从而为后续的膜融合与病毒入侵铺平道路。

该研究的科学意义重大。首先，它将胆固醇对病毒入侵的促进作用精确锁定在“病毒膜”这一特定空间，并解析了其通过“Spike蛋白胞质尾”这一特定分子模块起作用，突破了以往将胆固醇作用笼统归因于脂筏或膜流动性的认知。其次，研究发现了胆固醇驱动Spike蛋白寡聚化这一此前未知的调控机制，为理解包膜病毒融合蛋白的活化和组织提供了新视角。最后，也是最具转化潜力的，是研究明确了CRR及其棕榈酰化修饰是胆固醇依赖的病毒入侵的关键枢纽。鉴于CRR在SARS-CoV-2及其变异株乃至其他冠状病毒中的高度保守性，针对这一相互作用的干预（如开发抑制棕榈酰化或竞争性结合CRR的多肽/小分子），有望成为一种不依赖于Spike受体结合域(RBD)、具有广谱抗冠状病毒潜力的全新治疗策略。同时，研究也为临床上探索使用安全性更高的环糊精衍生物（如HP-β-CD）通过耗竭病毒膜胆固醇来抑制感染提供了更深层的理论依据。总之，这项研究不仅增进了对冠状病毒基础生物学的理解，也为应对当前及未来可能的冠状病毒威胁指明了新的药物研发方向。