《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Extraocular delivery of bioswitchable tri-miR-22-loaded tetrahedral DNA nanostructures for intraocular neovascular and neurodegenerative repair
编辑推荐：
当前抗VEGF疗法虽可抑制眼底新生血管渗漏，但存在对神经退行性病变无效、无法改善视网膜灌注、需频繁玻璃体腔注射等局限。研究人员开发了一种基于四面体框架DNA（tFNAs）的生物可切换三重miR-22模拟物递送系统（BiRDS），通过结膜下给药实现药物穿透，在动物模型中证实其不仅能有效抑制病理性新生血管，还可促进健康血管重塑、保护视网膜神经元及功能。该研究为眼科神经血管疾病提供了一种全新的、微创、多靶点治疗策略。
在眼科疾病领域，如糖尿病视网膜病变和湿性年龄相关性黄斑变性，异常血管生长和渗漏常常是视力丧失的直接原因。多年来，向眼球内注射抗血管内皮生长因子（VEGF）药物已成为临床控制这类新生血管性疾病的主流手段，挽救了无数患者的视力。然而，这种“狙击”VEGF的疗法并非万能。高达30%-50%的患者反应不佳，提示还有其他病理信号通路在“作祟”。更重要的是，现有疗法本质上只针对血管异常，对伴随发生的视网膜神经元损伤束手无策，无法修复已经受损的神经功能。此外，频繁的眼内注射本身存在眼内炎等风险，给患者带来身心负担和治疗依从性难题。那么，有没有一种方法，能够“一箭双雕”，同时抑制病理性血管生长并保护脆弱的神经元，而且还能避免反复的眼内穿刺呢？
为了回答这个问题，来自中山大学中山眼科中心与四川省人民医院的研究团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了一项创新性研究。他们巧妙地将目光投向了microRNA-22（miR-22，一种具有抑制血管新生和神经保护双重潜能的微小RNA）和四面体框架核酸（tFNAs，一种具有优异生物相容性和细胞穿透能力的DNA纳米结构），设计并构建了一种名为“基于四面体框架DNA的生物可切换三重miR-22模拟物递送系统”，简称BiRDS。这个系统就像一辆精心设计的“智能纳米卡车”：其骨架是稳定的tFNA四面体结构，内部装载了三份miR-22模拟物“货物”，并通过特殊的DNA-RNA杂合“开关”设计，确保“货物”在进入细胞后能被特定的酶（RNase H）触发释放，从而精准发挥作用。
为开展此项研究，研究人员运用了多项关键技术。在纳米载体构建与表征方面，他们通过一锅法退火自组装合成BiRDS，并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）验证了其成功组装、形貌、尺寸和电位。在细胞与动物模型验证中，研究采用了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的缺氧模型，通过CCK-8、EdU掺入、Transwell小室和成管实验评估BiRDS的细胞活性和抗血管生成能力；并建立了激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）小鼠/大鼠模型以及氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，通过荧光素眼底血管造影（FFA）、光学相干断层扫描（OCT）、视网膜铺片免疫荧光染色、视网膜切片免疫组化及视网膜电图（ERG）等手段，在体评价了BiRDS经结膜下给药后的眼内分布、治疗效果（抑制病理性血管、促进生理性血管、保护神经元）及对视功能的影响。在机制探索层面，研究人员对经BiRDS处理的HUVECs进行了RNA测序（RNA-seq）分析，并结合定量聚合酶链反应（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色，从转录组和蛋白水平验证了其作用的核心信号通路。
研究结果部分归纳如下：
BiRDS的合成与表征
研究人员成功合成了BiRDS。电泳、TEM和AFM证实其形成了预期的四面体纳米结构，DLS显示其尺寸约为15.19 nm，携带负电荷。细胞实验表明，Cy5标记的BiRDS能在24小时内有效被HUVECs摄取并积累在细胞质中。
BiRDS在体外抑制缺氧诱导的HUVEC增殖、迁移和病理性血管生成
在缺氧条件下，BiRDS能显著抑制HUVECs的增殖（EdU实验）、迁移（Transwell实验）和体外成管能力，其效果与临床一线抗VEGF药物阿柏西普（Aflibercept, AFL）相当，而单独的miR-22或tFNAs载体效果有限。
眼内（玻璃体腔）给药的BiRDS有效抑制激光诱导的CNV
在大鼠激光诱导CNV模型中，玻璃体腔注射BiRDS能在第14天和第21天显著减小CNV病灶面积和渗漏，其抑制效果与AFL组相当。
结膜下给药的BiRDS可实现眼内穿透和视网膜靶向：从眼内给药到眼外给药的跨越
这是本研究的关键突破。Cy5标记的BiRDS经小鼠结膜下注射后，能有效穿透眼部屏障。荧光成像显示，药物在1小时内即可在脉络膜检测到，6小时后在视网膜出现，并在18小时内持续分布。这表明BiRDS能够通过“巩膜-脉络膜-视网膜”途径到达眼底靶组织，实现微创的结膜下给药替代侵入性的玻璃体腔注射。
靶向脉络膜的结膜下给药BiRDS抑制CNV
在小鼠激光CNV模型中，结膜下注射BiRDS能显著减小CNV病灶的渗漏面积（FFA评估）和病灶尺寸（OCT评估），疗效与玻璃体腔注射AFL相当，且优于单独的miR-22或tFNAs载体。
靶向脉络膜的结膜下给药BiRDS抑制视网膜新生血管（RNV）
在OIR模型中，结膜下给予BiRDS能有效减少视网膜病理性新生血管区域，效果与AFL相当。更重要的是，BiRDS还能显著缩小视网膜无灌注区（avascular area），而AFL对此无明显改善，这显示了BiRDS在缓解视网膜缺血、促进生理性血管再灌注方面的独特优势。
结膜下给药的BiRDS抑制病理性血管出芽并促进健康血管生成
BiRDS治疗减少了OIR视网膜中从静脉异常出芽的血管面积。同时，它增加了血管生长前沿的内皮尖端细胞（tip cell）数量和丝状伪足（filopodia）延伸，这表明BiRDS在抑制病理性血管的同时，还能促进健康的生理性血管重建。
结膜下给药的BiRDS在OIR模型中保护视网膜神经元
缺氧缺血会导致视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡和胶质细胞活化。免疫荧光结果显示，BiRDS治疗显著降低了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达（表明减轻了胶质细胞活化），并保留了更多的Tuj1+神经节细胞、PKC-α+双极细胞、视紫红质（Rhodopsin）+视杆细胞和钙结合蛋白（Calbindin）+水平细胞。这表明BiRDS对多种类型的视网膜神经元具有广泛的保护作用。
结膜下给药的BiRDS保护视网膜神经功能
ERG检测从功能层面验证了神经保护效果。与对照组相比，BiRDS治疗组小鼠的暗适应（视杆细胞主导）和明适应（视锥细胞主导）ERG的a波、b波振幅，以及振荡电位（OPs）振幅均得到显著增强，表明其视网膜光感受器、双极细胞及内层视网膜的神经信号传导功能得到了更好的保留。
转录组分析揭示BiRDS通过调节Wnt通路介导神经血管保护
RNA-seq分析发现，BiRDS处理逆转了缺氧引起的许多基因表达变化，其中经典Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路的相关基因富集显著。qPCR和Western blot验证进一步证实，BiRDS能下调该通路关键分子Frizzled 4（FZD4）和β-catenin的mRNA及蛋白表达，同时上调糖原合酶激酶3β（GSK3β）的表达。在OIR小鼠视网膜中也观察到了相同的蛋白表达变化模式。这表明，BiRDS通过递送miR-22，抑制了Wnt/β-catenin信号通路的过度激活，这可能是其同时发挥抗血管新生和神经保护双重功效的核心分子机制。
结论与讨论归纳：
本研究成功开发并验证了BiRDS这一创新的纳米递送平台。其重要意义在于实现了多个维度的突破：在给药途径上，首次证实了基于tFNA的核酸药物可通过结膜下这种微创、门诊可操作的方式，有效穿透眼球屏障到达眼底视网膜，为替代频繁、有创的玻璃体腔注射提供了全新方案。在治疗效能上，BiRDS不仅表现出与现有抗VEGF药物相当的抑制病理性新生血管的能力，更具备了当前疗法缺乏的独特优势——促进健康的生理性血管重建以改善视网膜灌注，以及全面保护视网膜神经元结构和功能，真正实现了对“视网膜神经血管单元”的综合修复。在作用机制上，研究揭示了其通过调节Wnt/β-catenin这一在多种眼病中关键的信号通路，来协调发挥血管和神经保护作用。
总之，BiRDS代表了一种从单纯“抗血管”到“神经血管综合修复”的范式转变。它通过一个微创的给药平台，将一个具有多靶点调控潜力的治疗分子（miR-22）高效递送至病灶，同步应对眼底疾病的血管异常和神经退行两大核心病理过程。这项工作为治疗糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等顽固性致盲眼病，提供了一个极具临床转化前景的下一代RNA纳米治疗策略。
