《Acta Biomaterialia》：Cell-Targeted Nanocomplex Facilitates Direct Reprogramming of Astrocytes into Dopaminergic Neurons in Parkinson’s Disease
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靶向星形胶质细胞的功能化金纳米颗粒复合物实现高效在体多巴胺能神经元重编程，显著改善帕金森病小鼠模型运动功能并恢复 striatal 多巴胺水平。
黄Yerim|Neethu Ramakrishnan|金俊烨|金秀敏|朴正贤|权大烨|安秀敏|权龙渊|金钟泌
韩国首尔东国大学化学系干细胞与再生医学研究所（ISR），邮编10326
摘要
直接在体内对多巴胺能神经元进行重编程是一种变革性的方法，能够在大脑中生成新的功能性多巴胺能神经元，并为帕金森病提供直接的治疗潜力。然而，成人大脑复杂的微环境以及细胞特异性方面的持续障碍，继续挑战着将其转化为诱导多巴胺能（iDA）神经元的效率和成功率。为了克服这些限制，我们开发了一种针对星形胶质细胞的系统，利用带有细胞特异性配体的功能化金纳米粒子纳米复合物来实现定向转化。该系统在体外和体内均促进了星形胶质细胞向多巴胺能神经元的有效转化，并且在目标星形胶质细胞中显著表达了多巴胺能标记物。此外，这种针对星形胶质细胞的纳米复合物激活了成功的重编程途径，进一步提高了重编程的效果。在6-OHDA诱导的帕金森病小鼠模型中应用该细胞靶向纳米复合物系统后，新生成的多巴胺能神经元数量显著增加，纹状体中的多巴胺水平得到恢复，多种运动功能也得到了显著改善。这些发现表明，这种细胞靶向的功能化纳米复合物能够实现高度选择性的体内重编程，为帕金森病提供了一种有前景的靶向治疗策略。
意义声明
将胶质细胞直接重编程为多巴胺能神经元是治疗帕金森病的一种有前景的方法，尽管在成人大脑中实现选择性和高效转化仍具有挑战性。在这里，我们报道了使用功能化金纳米粒子纳米复合物在体内实现星形胶质细胞向多巴胺能神经元的定向重编程。该平台能够高效地将星形胶质细胞转化为功能性多巴胺能神经元，从而在帕金森病小鼠模型中恢复多巴胺水平并改善运动功能。与非靶向方法不同，我们的系统实现了高精度靶向和成功的直接细胞转化。总体而言，这些结果表明，精密设计的、细胞选择性的生物材料可以有效地指导大脑中的细胞命运，这是朝着安全且靶向的再生疗法迈出的重要一步。
引言
直接在体内将星形胶质细胞重编程为多巴胺能神经元已成为一种有前景的策略，用于重建受损的黑质-纹状体回路并恢复帕金森病的运动功能，而无需进行细胞移植或永久性的基因组整合[1,2]。然而，当前体内星形胶质细胞向神经元重编程策略的一个根本局限性在于其在成人大脑中的效率和稳健性有限。尽管已经确定了多种能够生成诱导多巴胺能（iDA）神经元的转录因子组合，但体内的重编程结果仍然变化很大。这种变异性主要源于成人大脑复杂的微环境，其特征是细胞异质性明显、损伤相关状态多样以及星形胶质细胞反应性的区域差异，这些因素共同阻碍了一致的神经元转化和功能恢复。因此，这些限制当前体内重编程策略的挑战凸显了精确、细胞类型特异性递送重编程因子的关键必要性。然而，传统的病毒载体和非靶向纳米粒子系统会将转录基因广泛分布到多种神经元类型中，包括星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞[3,4]。特别是，这种非选择性递送可能会在星形胶质细胞群体中稀释重编程因子，引起非星形胶质细胞的稳态功能紊乱，并促进部分或异位重编程，导致异常或不稳定的细胞表型。由于将星形胶质细胞转化为iDA神经元需要高水平和持续表达谱系特异性调节因子，因此需要一个靶向递送平台来确保重编程的效果和安全性[5]。此外，最近的数据表明，成功的iDA转化效率取决于关键分支点处信号的调控，这些信号指导星形胶质细胞的转录组轨迹朝向多巴胺能谱系[6]。
已经开发出多种纳米载体平台以实现细胞类型选择性的基因递送。例如，抗体和配体功能化的脂质纳米粒子（LNPs）展示了精确的核酸递送能力，例如抗VCAM-1 LNPs能够优先积聚在炎症血管内皮中，并促进mRNA穿过血脑屏障[7]。同时，肽和糖修饰的LNPs（包括Epi-1和甘露糖修饰的配方）利用细胞表面受体相互作用将遗传物质定向递送到EpCAM阳性的肿瘤细胞或树突状细胞[8,9]。肽模拟LNPs进一步利用内源性转运蛋白和受体介导的摄取途径，实现靶向递送或选择性沉默小胶质细胞的TLR4，从而减轻神经炎症反应[10]。总体而言，这些靶向纳米载体确保了转录基因的选择性积累，优化了对目标细胞类型的递送，同时降低了系统性的脱靶风险。这些特性对于体内直接重编程尤为重要，需要实现靶向表达以实现精确的谱系转化并减少对非目标群体的功能干扰。尽管取得了这些进展，基于脂质的纳米载体系统在成人脑实质中仍存在显著局限性。例如，在病理条件下无法独立调节LNPs的表面特性而不影响其结构完整性[11,12,13]。因此，这些挑战突显了需要一个更模块化、结构更稳健的纳米平台，以便在中枢神经系统中实现精确的细胞类型特异性靶向。
在这种情况下，金纳米粒子（AuNPs）作为一种有吸引力的替代纳米平台出现，能够解决基于脂质系统的几个固有限制。AuNPs具有刚性且定义明确的无机核心，尺寸和表面化学性质可控，能够形成具有高胶体稳定性和可预测行为的纳米复合物。重要的是，金表面通过硫醇-金化学支持密集和稳定的功能化，允许独立且模块化地控制表面电荷、配体密度、亲水性和靶向基团，而不影响结构完整性[14,15]。此外，先前的研究表明，基于AuNP的系统（包括电磁响应配方）可以增强体细胞向iDA神经元的直接谱系重编程，并支持高效的基因递送到神经元细胞，说明它们适用于中枢神经系统（CNS）的应用和重编程范式[16,17]。基于此基础，本研究利用AuNPs作为模块化支架，将细胞穿透性、核酸装载和抗体介导的靶向整合到一个统一的星形胶质细胞特异性重编程平台中。
在这项研究中，为了实现精确的体内星形胶质细胞靶向重编程，使用了ACSA2作为细胞表面配体。ACSA2识别ATP1B2，这是一种从新生儿阶段到成年期在多个脑区选择性且稳定表达在星形胶质细胞上的膜蛋白，并已被广泛用于基于免疫亲和力的协议中，从健康和患病的中枢神经系统（CNS）组织中分离出高纯度的星形胶质细胞群体[18,19]。ACSA2的可重复星形胶质细胞特异性和稳定的体内表达谱使其成为限制基因递送到星形胶质细胞同时避开神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞的理想靶向工具。通过将抗ACSA2抗体与肽修饰的AuNPs结合，得到的星形胶质细胞靶向纳米复合物能够选择性地结合并内化到ACSA2阳性的星形胶质细胞中，从而将重编程因子集中在目标细胞谱系中。
此外，通过用两种特定基序（RRR-peg-SH，一种促进细胞穿透和细胞摄取的肽；RRGW-peg-SH，一种确保抗体定向结合的Fc结合肽）对PEG化的AuNP核心进行功能化，合理设计了修饰后的AuNPs（mAuNPs）。这种模块化结构支持逐步组装编码Ascl1、Pitx3、Nurr1和Lmx1a的质粒DNA、聚乙烯亚胺以及抗ACSA2抗体，以实现高效的核酸浓缩和星形胶质细胞特异性靶向。由此产生的星形胶质细胞靶向mAuNP复合物（at-mAuNPs）旨在克服传统重编程方法的关键效率问题，通过向星形胶质细胞高效且局部递送多巴胺能重编程因子，同时最小化其他神经元类型的脱靶摄取。利用该系统，本研究旨在在帕金森病模型中实现高效且安全的纹状体星形胶质细胞向功能性诱导多巴胺能（iDA）神经元的直接转化，从而展示了基于AuNP的细胞类型特异性基因递送如何解决体内直接重编程中的关键瓶颈。
材料
固相树脂和保护性氨基酸购自NovaBiochem（德国达姆施塔特）。mPEG-SH（分子量约350 Da）、HAuCl?·3H?O和柠檬酸钠购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。合成肽配体在Alliance 2796高效液相色谱（HPLC）系统上进行分析，该系统配备双吸光度检测和四极杆质谱仪（Waters，马萨诸塞州米尔福德），使用Vydac C18柱（5 μm，4.6 × 150 mm；Grace，哥伦比亚州）。分离
用于直接重编程的AuNPs基细胞靶向纳米复合物的制备和表征
为了制备细胞类型特异性的DNA递送纳米载体，我们修改了之前报道的RRRGYC–AuNP/DNA/PEI系统[24]。在这项工作中，AuNP表面用两种多肽RRR-peg-SH和RRGW-peg-SH进行了功能化，并额外引入了mPEG-SH作为独立的PEG化成分。在修饰后的纳米粒子中，RRR基序来自细胞穿透肽序列，以增加AuNP的细胞表面结合和穿透能力；RRGW基序来自Fc结合
讨论
在这项研究中，我们开发了一种基于AuNP的多功能纳米载体系统，以实现星形胶质细胞向多巴胺能神经元的特异性递送，用于6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病小鼠模型中的直接转化。与依赖广泛和非选择性转录因子递送的传统直接重编程方法不同，我们的策略强调了在异质性环境中实现细胞类型特异性和空间限制的基因递送的必要性
结论
本研究表明，靶向at-mAuNPs的星形胶质细胞能有效促进星形胶质细胞向成熟且功能性的多巴胺能神经元的直接转化。这一机制似乎涉及at-mAuNPs介导的精确递送，使重编程因子能够高效激活星形胶质细胞内的关键基因调控途径。体外和体内分析均显示，at-mAuNPs介导的递送显著增加了iDA神经元的数量，增强了多巴胺的合成
作者贡献
YH主要参与了这项工作并担任第一作者。概念构思：YH、JYK、NR、JK、YK。方法学：YH、NR、SK、JP。实验研究：YH、JYK、JP、SK。数据分析：YH、DK、SA。验证：YH、NR、SA。可视化：YH、NR。资源获取：NR、YK。资金筹集：JK。监督：JK。初稿撰写：YH、NR、YK、JK。审稿与编辑：YH、NR、YK、JK。
补充材料
配体密度、抗体结合的定量表征
CRediT作者贡献声明
黄Yerim：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、实验研究、数据分析、概念构思。Neethu Ramakrishnan：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、资源获取、方法学、数据分析、概念构思。金俊烨：实验研究、概念构思。金秀敏：方法学、实验研究。朴正贤：方法学、实验研究。权大烨：数据分析。
