利用可在现场使用的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RCA）和CRISPR/Cas12a切割活性检测技术，对空气中的食源性病原体进行现场检测
《Biosensors and Bioelectronics》：On-site Detection of Airborne Foodborne Pathogens Using a Field-deployable Recombinase Polymerase Amplification and CRISPR/Cas12a Cleavage Activity Assay
编辑推荐：
空气传播食源性细菌检测；重组酶聚合酶扩增（RPA）；CRISPR/Cas12a cleavage activity；快速诊断；便携式检测平台
郑妍宇|李智娜|崔尚洙|申东民|张秀珍|孙成旭|姜泰俊|郑珠妍|黄俊浩|林恩京
韩国生物科学与生物技术研究院（KRIBB）生物纳米技术研究中心，大田 34141，大韩民国
摘要 随着全球单人家庭数量的增加，对即食餐盒的需求也在增长，这促使了大规模食品生产系统和复杂供应链的发展。然而，在全球变暖的影响下，这些系统容易受到食品污染，尤其是空气中的食源性细菌的污染。传统的检测空气细菌的方法复杂、耗时且劳动强度高，限制了其在现场应用和快速食品卫生监测中的有效性。在本研究中，我们结合了重组酶聚合酶扩增技术和CRISPR/Cas12a切割活性（RCCVA检测法），开发了一个可用于现场的诊断平台，以实现快速、灵敏地识别空气中的食源性细菌。使用自制的静电空气采样器收集空气中的细菌，并通过便携式等温扩增设备进行分析。RCCVA检测法能够检测四种主要的食源性病原体：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。检测限分别为274.9、4.5、9.5和28.5个菌落形成单位（CFU）/mL，检测时间仅需45分钟。该平台能够在大约1小时内实现现场早期检测，并具有在食品加工环境中进行实时监测的潜力，从而有助于改善公共卫生和食品安全。
引言 随着全球单人家庭数量的增加，对即食餐盒的需求也在增长（Euromonitor International 2020；美国人口普查局 2023；Eurostat 2025）。这一趋势推动了大规模食品生产系统的开发和复杂供应链的扩展（Badia-Melis等人 2018；James 2023）。然而，在全球变暖的影响下，这些系统更容易受到食品污染和变质的影响。食品中毒是这种污染最著名的后果，每年导致约42万人死亡（世界卫生组织 2024）。因此，必须在整个生产和分销过程中系统地管理食品污染，并在食品设施中尽早进行现场检测。根据美国食品药品监督管理局（FDA）发布的《Bad Bug Book》，多种细菌菌株会导致食品中毒，其中一些可以通过空气传播，被归类为空气传播细菌。例如，金黄色葡萄球菌已在医院、污水处理设施和畜牧场等受污染环境中被检测到（Kozajda等人 2019）。肠炎沙门氏菌已知会通过家禽等鸟类造成空气传播（Gast等人 1998, 2004）。此外，单核细胞增生李斯特菌对红肉加工行业构成重大威胁（Dobeic等人 2011），而蜡样芽孢杆菌被认为是一种易变且具有致病性的细菌（Bottone 2010）。此外，多项研究报道了食源性细菌的空气传播和感染案例，揭示了食品链中的潜在污染途径（Oliveira等人 2006；Stein和Chiril? 2017；Yong等人 2024）。因此，有效控制空气中的细菌对于保护公共卫生至关重要。迄今为止，已经开发了多种现场空气细菌检测方法以确保空气质量（Qiu等人 2023；Yong等人 2024）。然而，在大多数情况下，收集的空气样本在鉴定和分析之前需要额外的培养步骤。为了克服细菌培养的复杂性和时间消耗，引入了基于蛋白质组和核酸的分析技术（Anaya等人 2007；Chen等人 2023；Qiu等人 2023；Quijano-Rubio等人 2021）。其中，聚合酶链反应（PCR）和实时PCR是最广泛使用的，被认为是金标准的基于核酸的分子诊断技术（Chen等人 2023；Pogner等人 2024；Unterwurzacher等人 2018；Watt等人 2020）。然而，这些技术存在固有的局限性，包括需要熟练的人员、劳动密集型的程序、较长的处理时间以及对配备荧光检测系统的复杂热循环仪器的依赖。作为替代方案，包括环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、指数扩增反应（EXPAR）和基于核酸序列的扩增（NASBA）在内的等温扩增方法被广泛使用（美国食品药品监督管理局 2020；Gl?kler等人 2021；Huang等人 2018；Li等人 2017；Liu等人 2021；Seo等人 2025；Song等人 2019；Wang等人 2024；Yang等人 2019；Yao等人 2024；Zhao等人 2015；Zheng等人 2025）。例如，LAMP介导的SARS-CoV-2检测方法于2020年获得了美国食品药品监督管理局的批准（美国食品药品监督管理局 2020）。LAMP已被用于不同应用中的多种病原体检测。例如，Huang等人使用LAMP检测了食品样本中的大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门氏菌的毒力基因（Huang等人 2018）。基于RCA的方法已被用于检测坂崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和金黄色葡萄球菌（Liu等人 2021；Song等人 2019；Yang等人 2019）。RCA扩增产物可以促进DNA酶的形成，如G-四链结构，从而产生可检测的信号（Seo等人 2024；Song等人 2019）。另一种方法RPA也因其简单性和在等温条件下的快速扩增能力而被广泛用于食源性细菌的检测（Fu等人 2025；Liu等人 2022；Wang等人 2020；Zhang等人 2025）。基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白复合体（CRISPR/Cas）的分子诊断系统因可编程性和高目标特异性而受到广泛关注（Ki等人 2023；Li等人 2023；Song等人 2023；Yang等人 2023）。为了增强信号传导，CRISPR/Cas系统通常与其他目标扩增方法结合使用。基于这一策略，He等人将RCA与CRISPR/Cas12a系统结合，开发了一种用于从细胞外囊泡中敏感检测miRNA的一锅法检测方法（Yan等人 2023）。同样，Chen等人将RCA与CRISPR/Cas12a结合，通过电化学信号检测大肠杆菌O157:H7（Chen等人 2021）。Liu等人还报告了使用RPA与CRISPR/Cas12a检测食品基质中的沙门氏菌（Liu等人 2022）。Zhang等人结合RPA和CRISPR/Cas系统开发了一种双模式检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的平台（Zhang等人 2025）。荧光探针被金纳米颗粒（AuNPs）淬灭，当识别到目标时，CRISPR/Cas系统会从AuNPs中释放荧光探针，恢复荧光。同样，Arshad等人使用RPA/CRISPR-Cas12a系统和CeO2纳米酶作为信号报告剂来检测沙门氏菌（Arshad等人 2024）。尽管取得了显著进展，但RPA-CRISPR/Cas系统在空气细菌现场检测中的应用仍需进一步探索。因此，我们使用RPA-CRISPR/Cas系统来检测空气中的食源性细菌。使用自制的静电空气采样器收集空气中的细菌，随后通过便携式等温扩增设备进行分析。设计了基于RPA/CRISPR的试剂，专门用于检测四种主要的食源性病原体：金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌。收集空气中的细菌后，使用重组酶聚合酶扩增（RPA）-CRISPR/Cas12a切割活性（RCCVA检测法）进行快速现场分析（图1）。
RPA引物和crRNA在RCCVA检测中的性能评估 对于RCCVA检测，首先设计了针对食源性病原体相关细菌毒力基因的RPA引物，包括金黄色葡萄球菌的LukE、肠炎沙门氏菌的invA和pipD、蜡样芽孢杆菌的EntFM以及单核细胞增生李斯特菌的actA和plcB。RPA引物及其结合位点分别如图2a–5a所示。相应的RPA引物序列列于表S1中。为了验证每个RPA引物组的特异性反应性，从每种
结论 在本研究中，我们成功开发了一个可用于现场检测空气中的食源性细菌的监测平台。使用自制的静电空气采样器收集空气中的细菌，随后结合便携式等温扩增设备和RCCVA DNA检测系统进行分析。该平台消除了耗时的程序和对复杂PCR仪器的需求，同时提高了灵敏度和特异性。
材料 PBS（片剂）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒购自Qiagen（德国希伦）。TwistAmp? Liquid Basic试剂盒购自TwistDx（美国马萨诸塞州剑桥）。DEPC处理的水购自SolBio（韩国水原），10× TBE缓冲液购自Biosesang（韩国京畿道华城市）。dNTPs（10 mM，每种2.5 mM）、DNA寡核苷酸和AccuPrep?基因组DNA提取试剂盒购自Bioneer
CRediT作者贡献声明 张秀珍： 资源、方法学。
申东民： 方法学、调查。
姜泰俊： 资金获取。
孙成旭： 验证、资源。
黄俊浩： 写作——审稿与编辑、写作——初稿、资金获取。
郑珠妍： 资源、资金获取。
林恩京： 写作——审稿与编辑、写作——初稿、项目管理、概念化。
郑妍宇： 写作——初稿、数据管理、概念化。
崔尚洙： 方法学
利益冲突声明 ? 作者声明他们没有可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢 本研究的数据可在韩国生物数据站（K-BDS，
http://kbds.re.kr ）的访问号KAP241790下获取。本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）和韩国国家科学技术委员会（NST）的支持，资金来自韩国政府（MSIT）（2023R1A2C2005185、RS-2024-00348576、RS-2024-00459749、RS-2025-00554718、2020R1A5A1018052和GTL25061-000）；以及韩国工业技术评价研究所（KEIT）的支持
